MyD88在OK-432誘導樹突狀細胞成熟中的作用.pdf

1、目的：本課題旨在應用RNAi(RNA interference)技術探討小鼠骨髓樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)髓性分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)在OK-432誘導的DCs成熟中作用機制，為DCs成熟機制提供新的研究切入點。
　　 方法：采用貼壁粘附法分離小鼠骨髓單個核細胞，并在含10％胎牛血清(FCS)、重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM

2、-CSF)、重組小鼠白細胞介素-4(rmIL-4)的培養(yǎng)體系中誘導培養(yǎng)，以OK-432作為DCs的成熟刺激因子。將實驗分為3組：空白對照組不加任何藥物,OK-432組加入終濃度為5μg/ml的OK-432，RNA干擾組加入MyD88 siRNA12小時后再加入5μg/ml OK-432刺激。倒置顯微鏡和瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色觀察細胞形態(tài)；流式細胞儀檢測DCs表面抗原CD83的表達情況；半定量RT-PCR法檢測DC

3、s中MyD88及NF-κB mRNA的表達；ELISA法檢測各組DCs分泌IL-12和TNF-α的濃度；并用MTT法檢測DCs體外刺激同種混合淋巴細胞增殖的免疫活性和DCs誘導的CTL對小鼠前胃癌細胞的細胞毒作用。
　　 結(jié)果：
　　 1小鼠骨髓單核細胞在含10％FCS、rmGM-CSF和rmIL-4的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至第七天即分化成形態(tài)正常的未成熟DCs(Immature DCs，imDCs)，加入OK-432后其形態(tài)具

4、備成熟的特征，而用MyD88 siRNA干擾后，則抑制了DCs的成熟。
　　 2培養(yǎng)第七天的DCs表面抗原CD83測定結(jié)果示，OK-432組CD83表達率(13.17±0.93)比空白組(3.00±0.44)明顯上調(diào)，而RNA干擾組(5.97±0.59)與OK-432組相比則顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3 DCs中MyD88及NF-κB mRNA的表達測定結(jié)果示，OK-432組高于空白組和RN

5、A干擾組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4 DCs上清液中細胞因子IL-12和TNF-α濃度測定結(jié)果顯示，OK-432組DCs分泌的細胞因子濃度(IL-12：76.53±7.60 pg/ml，TNF-α：109.49±17.73 pg/ml)明顯高于空白組(IL-12：23.41±5.14 pg/ml，TNF-α：40.71±8.19 pg/ml)，加入MyD88 siRNA之后，DCs所分泌的細胞因子(IL-12

6、：30.09±4.98 pg/ml，TNF-α:49.80±5.57 pg/ml)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 5 DCs刺激混合淋巴細胞增殖反應及誘導的CTL對前胃癌細胞株的細胞毒作用均顯示，OK-432組明顯高于空白組，而RNA干擾組則低于OK-432組，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 OK-432促使DCs中MyD88及NF-κB高表達、TNF-α和IL-