MyD88在OK-432誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟中的作用.pdf

1、目的：本課題旨在應(yīng)用RNAi(RNA interference)技術(shù)探討小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)髓性分化因子88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)在OK-432誘導(dǎo)的DCs成熟中作用機(jī)制，為DCs成熟機(jī)制提供新的研究切入點(diǎn)。
　　 方法：采用貼壁粘附法分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，并在含10％胎牛血清(FCS)、重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM

2、-CSF)、重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)的培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)培養(yǎng)，以O(shè)K-432作為DCs的成熟刺激因子。將實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對照組不加任何藥物,OK-432組加入終濃度為5μg/ml的OK-432，RNA干擾組加入MyD88 siRNA12小時(shí)后再加入5μg/ml OK-432刺激。倒置顯微鏡和瑞氏-姬姆薩(Wright-Giemsa)染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測DCs表面抗原CD83的表達(dá)情況；半定量RT-PCR法檢測DC

3、s中MyD88及NF-κB mRNA的表達(dá)；ELISA法檢測各組DCs分泌IL-12和TNF-α的濃度；并用MTT法檢測DCs體外刺激同種混合淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性和DCs誘導(dǎo)的CTL對小鼠前胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　 結(jié)果：
　　 1小鼠骨髓單核細(xì)胞在含10％FCS、rmGM-CSF和rmIL-4的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至第七天即分化成形態(tài)正常的未成熟DCs(Immature DCs，imDCs)，加入OK-432后其形態(tài)具

4、備成熟的特征，而用MyD88 siRNA干擾后，則抑制了DCs的成熟。
　　 2培養(yǎng)第七天的DCs表面抗原CD83測定結(jié)果示，OK-432組CD83表達(dá)率(13.17±0.93)比空白組(3.00±0.44)明顯上調(diào)，而RNA干擾組(5.97±0.59)與OK-432組相比則顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3 DCs中MyD88及NF-κB mRNA的表達(dá)測定結(jié)果示，OK-432組高于空白組和RN

5、A干擾組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4 DCs上清液中細(xì)胞因子IL-12和TNF-α濃度測定結(jié)果顯示，OK-432組DCs分泌的細(xì)胞因子濃度(IL-12：76.53±7.60 pg/ml，TNF-α：109.49±17.73 pg/ml)明顯高于空白組(IL-12：23.41±5.14 pg/ml，TNF-α：40.71±8.19 pg/ml)，加入MyD88 siRNA之后，DCs所分泌的細(xì)胞因子(IL-12

6、：30.09±4.98 pg/ml，TNF-α:49.80±5.57 pg/ml)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5 DCs刺激混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及誘導(dǎo)的CTL對前胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用均顯示，OK-432組明顯高于空白組，而RNA干擾組則低于OK-432組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 OK-432促使DCs中MyD88及NF-κB高表達(dá)、TNF-α和IL-