轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3參與干細(xì)胞多能性基因OCT4轉(zhuǎn)發(fā)調(diào)控機(jī)理初探.pdf

1、干細(xì)胞(Stem cell，SC)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。近年來(lái)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究為疾病治療提供了嶄新思路，極大的推動(dòng)了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。干細(xì)胞多能性維持與定向分化過(guò)程涉及特定基因表達(dá)的開(kāi)啟與關(guān)閉，依賴于復(fù)雜而精細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文以P19 EC細(xì)胞為體系，對(duì)干細(xì)胞多能性關(guān)鍵基因OCT4在干細(xì)胞分化早期的抑制表達(dá)機(jī)理作了初步探索。
　　轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3(Groucho-related gene3)屬于

2、Groucho輔助抑制因子(corepressor)家族，在胚胎發(fā)育及器官形成等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。以往的研究表明，由于蛋白序列中不具備DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子Grg3通常被能結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子招募至靶基因的調(diào)控區(qū)域，進(jìn)而可能通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)修飾狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制功能。本文中使用多種手段考察了Grg3參與多能性基因OCT4轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制。Grg3表達(dá)水平在P19細(xì)胞受維甲酸誘導(dǎo)向神經(jīng)分化的過(guò)程中維持不變，通過(guò)運(yùn)用Grg3特異性

3、siRNA以及外源Grg3-V5融合蛋白高表達(dá)質(zhì)粒工具，人們發(fā)現(xiàn)P19 EC細(xì)胞中OCT4表達(dá)水平受到Grg3蛋白水平變化的調(diào)節(jié)，高水平的Grg3抑制OCT4表達(dá)，干擾Grg3則使OCT4表達(dá)水平上升。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Grg3對(duì)OCT4的表達(dá)抑制是通過(guò)特異性結(jié)合在OCT4啟動(dòng)子-3500bp～-3345bp區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　轉(zhuǎn)錄因子FoxA1(Forkhead box A1)也叫HNF3α，屬于

4、叉頭蛋白家族(Forkheadfamily)并參與調(diào)節(jié)眾多生理過(guò)程。研究表明FoxA1是P19向神經(jīng)分化早期的關(guān)鍵因子，且在體外已被證明與Grg3存在蛋白-蛋白相互作用，本文中也通過(guò)免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)在胞內(nèi)證實(shí)了這一點(diǎn)。OCT4啟動(dòng)子-3500bp～-3345bp區(qū)域包含2個(gè)FoxA1結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，這2個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變將使Grg3對(duì)該啟動(dòng)子區(qū)域活性的抑制作用消失。因此，F(xiàn)oxA1可能是OCT4轉(zhuǎn)錄抑制中招募Gr