轉(zhuǎn)錄因子Foxml維持干細(xì)胞多能性的研究.pdf

1、多能干細(xì)胞具有在體外無限擴(kuò)增并保持未分化狀態(tài)的能力(自我更新)，且具有分化為機(jī)體中所有種類的細(xì)胞及形成嵌合體動(dòng)物的能力(分化)。干細(xì)胞多能性維持受特定轉(zhuǎn)錄因子復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog、Sox2參與干細(xì)胞多能性維持并阻斷分化特異性基因的表達(dá)。Foxml是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)Foxml調(diào)控細(xì)胞增殖與DNA損傷修復(fù)，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。本文著重研究Foxml是否參與維持干細(xì)胞多能性及相關(guān)分子

2、機(jī)制：運(yùn)用維甲酸(RA)誘導(dǎo)小鼠多能干細(xì)胞神經(jīng)分化模型，考察Foxml的表達(dá)水平與干細(xì)胞多能性的相關(guān)性，研究Foxml對(duì)干細(xì)胞多能性相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，證實(shí)Foxml對(duì)干細(xì)胞多能性維持的重要生理功能。本文研究結(jié)果歸納如下：
　　一：P19EC細(xì)胞是研究Foxml參與干細(xì)胞多能性維持的良好干細(xì)胞體系。為確定P19EC細(xì)胞的多能性干細(xì)胞特性，我們首先證實(shí)P19EC干細(xì)胞能在裸鼠皮下形成畸胎癌，該畸胎癌具有三胚層來源組織結(jié)構(gòu)：外

3、胚層來源神經(jīng)組織、中胚層來源肌肉組織、內(nèi)胚層來源小腸上皮組織。同時(shí)，體外運(yùn)用維甲酸誘導(dǎo)P19EC干細(xì)胞分化伴隨堿性磷酸酶活性的喪失。按標(biāo)準(zhǔn)化方法用維甲酸誘導(dǎo)P19EC干細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)分化，RA誘導(dǎo)P19EC神經(jīng)分化經(jīng)歷三個(gè)階段：第一階段P19EC多能性喪失(0-24h)；第二階段變?yōu)樯窠?jīng)干細(xì)胞(1-3d)；第三階段P19EC分化為神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細(xì)胞(6-7d)。在維甲酸誘導(dǎo)P19EC干細(xì)胞分化的早期，P19EC細(xì)胞堿性磷酸酶活性下降，失

4、去多能性特征。同時(shí)，F(xiàn)oxml及干細(xì)胞多能性維持基因Nanog、Oct4、Sox2和Utfl表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，F(xiàn)oxml在RA誘導(dǎo)1-2天時(shí)表達(dá)量急減，且Foxml下降發(fā)生在Nanog、Oct4等基因下調(diào)之前。
　　二：P19EC干細(xì)胞中抑制Foxml表達(dá)導(dǎo)致多能性喪失及干細(xì)胞多能性相關(guān)基因Oct4和Nanog表達(dá)水平下降。維甲酸誘導(dǎo)P19EC干細(xì)胞分化早期伴隨Foxml表達(dá)下降和已知干細(xì)胞多能性相關(guān)基因如Oct4、Nanog

5、、Sox2等的表達(dá)抑制。運(yùn)用能表達(dá)FoxmlsiRNA的腺病毒載體AdFoxmlshRNA感染P19EC細(xì)胞，抑制Foxml的表達(dá)，同時(shí)也導(dǎo)致多能性相關(guān)的堿性磷酸酶活性喪失，并造成Oct4、Nanog和Sox2表達(dá)水平下降，表明Foxml可能參與干細(xì)胞多能性的維持，并暗示Foxml可能參與Oct4、Nanog等干細(xì)胞多能性維持基因表達(dá)的調(diào)控。
　　三：P19EC干細(xì)胞中高表達(dá)Foxml阻止了干細(xì)胞分化過程中Oct4、Nanog和S

6、ox2表達(dá)下調(diào)。由于前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示Foxml對(duì)干細(xì)胞多能性維持具有作用并可能參與Oct4、Nanog等干細(xì)胞多能性維持基因表達(dá)的調(diào)控，我們決定考察高表達(dá)Foxml是否能抑制分化過程中多能性基因Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)下調(diào)。腺病毒載體AdFoxml感染P19EC細(xì)胞后能有效高表達(dá)Foxml。先用AdFoxml感染P19EC細(xì)胞再誘導(dǎo)分化過程，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Foxml阻止了分化過程中Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)下降。同時(shí)還

7、發(fā)現(xiàn)在已分化4天后的P19EC細(xì)胞高表達(dá)Foxml能夠回調(diào)多能性標(biāo)志基因的表達(dá)，表明Foxml能夠回調(diào)分化細(xì)胞中已下調(diào)表達(dá)的多能性相關(guān)標(biāo)志基因的編程狀態(tài)。
　　四：Oct4是Foxml的靶基因。通過基因序列分析，發(fā)現(xiàn)Oct4基因的-5kb上游啟動(dòng)子上含有多個(gè)Foxml的結(jié)合位點(diǎn)，分別在-3434bp至-3415bp、-2895bp至-2880bp、-1328bp至-1313bp存在Foxml結(jié)合位點(diǎn)的集中區(qū)域，暗示Foxml能夠直

8、接結(jié)合到Oct4的啟動(dòng)子上。運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)源性Foxml只結(jié)合于Oct4啟動(dòng)子的-3kb區(qū)域而不結(jié)合-1.3kb區(qū)域。將Oct4的啟動(dòng)子分段克隆到Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒上，與Foxml的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Oct4啟動(dòng)子的-3kb區(qū)域能有效介導(dǎo)Foxml的轉(zhuǎn)錄活性。
　　五：P19EC干細(xì)胞中抑制Foxml表達(dá)導(dǎo)致干細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性肌肉及中胚層分化。為進(jìn)一步確定Foxml與干細(xì)胞多能性維持有關(guān)，檢測了抑

9、制Foxml表達(dá)后的P19EC細(xì)胞的分化能力。首先發(fā)現(xiàn)干擾Foxml表達(dá)導(dǎo)致GATA4表達(dá)水平自發(fā)性增高。GATA4是心臟發(fā)育過程中的主要調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Foxml被抑制的P19EC細(xì)胞注射到裸鼠皮下所形成的畸胎癌，癌體積明顯小于對(duì)照組，并只發(fā)生中胚層方向的分化，特別是心肌細(xì)胞的分化，同時(shí)缺乏外胚層或內(nèi)胚層分化標(biāo)志物的表達(dá)，表明P19EC細(xì)胞中Foxml表達(dá)水平對(duì)干細(xì)胞多能性維持具有重要影響。
　　六：在人胚胎成纖維細(xì)胞(HE

10、Fs)中高表達(dá)Foxml重新啟動(dòng)Oct4、Nanog和Sox2表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)Foxml能夠回調(diào)分化細(xì)胞中多能性標(biāo)志基因的表達(dá)狀態(tài)，采用人胚胎成纖維細(xì)胞(hEFs)這一公認(rèn)的已分化細(xì)胞，用AdFoxml對(duì)hEFs進(jìn)行多次重復(fù)感染(3次/4天間隔)。在hEFs中強(qiáng)迫表達(dá)Foxml使成纖維細(xì)胞出現(xiàn)集落式生長，并且重新獲得堿性磷酸酶活性。高表達(dá)Foxml還導(dǎo)致hEFs中Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)升高，預(yù)示Foxml誘導(dǎo)hEFs重