干細胞因子Oct4在肝細胞癌中的表達及其功能和機制的研究.pdf

1、肝癌(主要是肝細胞癌,hepatocellular carcinoma,HCC)的預后較差。目前,手術切除仍為肝癌最有效的治療方法。但即使根治性切除,5年內仍有60％～70％的轉移復發(fā)率。轉移復發(fā)已成為進一步延長肝癌病人生存期、提高遠期療效的瓶頸問題,也是最終攻克肝癌的關鍵所在。
　　越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細胞由于具有自我更新、產生和維持腫瘤生長和導致細胞異質性的原始細胞及分化細胞的能力,是腫瘤發(fā)生和復發(fā)的根源。腫瘤干細胞和其它

2、成體干細胞高度相似,學者推測干細胞在體內通過長期的積累突變而獲得不確定的增殖能力進而轉化為腫瘤干細胞。因此在分子調控水平研究干細胞向肝癌干細胞發(fā)展的分子機制,有利于探索早期診斷和徹底治療肝癌的新方法。
　　研究發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2和Nanog在早期胚胎干細胞發(fā)育分化調節(jié)中發(fā)揮重要作用,其通過調節(jié)胚胎干細胞的基因轉錄,從而維持其多潛能性和自我更新的能力。
　　本課題首先研究此三個干細胞相關因子在HCC中的表達水平變化,并在此

3、基礎上進一步研究Oct4的表達對肝癌以及肝癌干細胞的細胞生物學行為的影響及其可能機制。
　　第一部分：肝細胞癌中干細胞相關因子Oct4,Sox2和Nanog的表達水平及其與腫瘤復發(fā)和預后的關系
　　一、免疫組織化學檢測肝細胞癌組織中干細胞相關轉錄因子Oct4,Sox2和Nanog的表達水平及其與預后的關系。
　　[目的]檢測HCC組織中干細胞相關轉錄因子Oct4,Sox2和Nanog的表達情況,評價相關因子對肝癌術后復

4、發(fā)及生存的影響。
　　[方法]用免疫組織化學染色法對126例肝癌組織進行分析。研究Oct4,Sox2和Nanog在肝癌中的表達情況和并結合患者的病理資料分析了其表達水平與肝癌患者術后復發(fā)和生存的相關性。
　　[結果]在HCC腫瘤組織中檢測到了Oct4和Sox2的表達,但是沒有檢測到Nanog的表達。
　　Oct4在HCC中主要分布在癌巢內,80例病人染色陽性(63.5％),9例病人癌旁染色陽性(7.1％);在癌巢內,O

5、ct4特異性著色在細胞核內,染色明顯;統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)Oct4的表達與肝癌術后生存及復發(fā)無明顯相關性。Oct4的表達與患者的年齡,性別,甲胎蛋白,肝硬化,腫瘤大小,包膜有無,血管侵犯和腫瘤分化情況均為明顯相關性。
　　Sox2在HCC的分布有兩種情況:一種情況是特異性表達在細胞膜上,在陽性染色區(qū)域,可見細胞輪廓呈現(xiàn)明顯的深棕色,胞漿胞核和細胞間質無明顯著色;另一種情況就是特異性的表達在胞漿,呈顆粒狀聚集、簇狀分布在胞核附近。癌旁組織內

6、有Sox2均勻的非特異性著色;癌組織內Sox2在細胞膜上的表達與肝癌術后生存和復發(fā)沒有明顯的相關性;Sox2在癌巢胞漿的表達與總生存沒有明顯相關性(p=0.871),與至復發(fā)時間明顯相關(p=0.012),癌組織胞漿內Sox2陰性患者的至復發(fā)時間明顯比Sox2陽性的患者要長。Sox2的表達情況與患者的年齡,性別,甲胎蛋白,肝硬化等臨床病理學特征沒有明顯相關性。
　　[結論]HCC組織中Oct4和Sox2的表達水平明顯上調,且與HC

7、C預后有關。
　　二、Taqman探針法驗證Oct4和Sox2在HCC病人中的mRNA水平表達。
　　[目的]鑒于肝癌組織結構和病理特征的復雜性,利用免疫組化方法明確的判定肝臟癌組織和癌旁組織有一定的難度,所以,我們利用特異性Taqman探針引物實時定量PCR,檢測HCC中Oct4和Sox2的mRNA表達水平。檢測Oct4和sox2在HCC配對的癌和癌旁中的的表達水平差異,探討Oct4和Sox2與HCC的關系。
　　[

8、方法](1)提取HCC組織的總RNA,進行逆轉錄。(2)使用特異性Taqman探針引物實時定量PCR,檢測HCC中Oct4和Sox2的InRNA表達水平。
　　[結果]與免疫組化的結果一致,Oct4主要在癌組織中表達(p=0.0157);驗證了Sox2免疫組化結果中癌旁的均勻著色為非特異性的背景染色,Sox2主要在癌組織中表達(p=0.022)
　　[結論]Oct4和Sox2在HCC癌組織中的mRNA表達水平明顯高于癌旁組織

9、。
　　三、不同轉移潛能的肝癌細胞系中Oct4和Sox2的表達水平
　　[目的]研究Oct4和Sox2在不同轉移潛能肝癌細胞系的表達水平,進一步驗證其在肝癌發(fā)展過程中發(fā)揮的作用。
　　[方法](1)選取并培養(yǎng)不同轉移潛能的肝癌細胞系Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF、HepG2,MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3。(2)提取各細胞系的總RNA,通過反轉錄獲得cDNA,并應用TaqMan(R)

10、MGB探針法對其進行定量檢測。(3)提取各細胞系的總蛋白,利用Western Blot檢測目的蛋白的表達。(4)利用細胞免疫熒光對Oct4和Sox2進行定位檢測。
　　[結果](1)mRNA和蛋白質水平上的檢測都發(fā)現(xiàn)Oct4在PLC/PRF、HepG2,MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3這五種細胞系中都有表達,而且表達水平是隨著其侵襲轉移能力增加而逐漸增強,差異顯著(P＜0.001)(2)mRNA和蛋白質水平上的檢測

11、發(fā)現(xiàn)Sox2在HCC細胞中的表達都很低,但是在具有轉移潛能的細胞MHCC97-L和MHCC97-H的表達明顯高于無轉移潛能的Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF和HepG2(P＜0.001)。(3)細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Oct4主要定位在細胞核,和之前的免疫組化結果一致:Sox2在細胞的胞膜,胞漿和胞核都有表達。
　　[結論]利用肝癌細胞系進一步證實Oct4和Sox2可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。并根據(jù)Oct4的

12、表達情況,選取PLC/PRF,HepG2和HCCLM3進行下一步Oct4功能和機制研究。
　　第二部分：Oct4對肝癌細胞生物學行為的影響及機制研究
　　一、載體構建、載體轉染/侵染和穩(wěn)定細胞株的篩選
　　[目的]構建Oct4過表達載體,篩選表達Oct4的穩(wěn)定轉染細胞株;包裝5個Oct4的慢病毒shRNA干擾載體PLK0.1,挑選干擾效果最好的shRNA干擾載體,挑單克隆,篩選穩(wěn)定細胞株。
　　[方法]根據(jù)第一部

13、分對HCC細胞系中Oct4蛋白表達情況的檢測結果,我們選取了Oct4基礎表達水平低的HepG2細胞和PLC/PRF,通過轉染Oct4表達質粒,獲得Oct4過表達細胞;選擇Oct4基礎表達水平高的HCCLM3,通過基因沉默阻斷其表達,通過正反兩個方面研究其對細胞生物學行為的影響。(1)構建Oct4過表達載體,并將其和對照空質粒分別轉染Oct4低表達肝癌細胞株PLC/PRF和HepG2,利用Hygromyein篩選獲得穩(wěn)定轉染細胞株。(2)

14、包裝5個Oct4的shRNA干擾載體PLK0.1和scramble的對照,侵染LM3后,挑選出干擾效果最好的shRNA。(3)將干擾效果最好的shRNA慢病毒侵染LM3和HepG2,利用Puromyein來挑單克隆,篩選穩(wěn)定細胞株。
　　[結果]經(jīng)測序證實構建的Oct4過表達載體的序列正確,讀碼框無誤;RealTimePCR和Westernblot檢測過表達穩(wěn)定細胞株Oct4的表達上調了5倍;同時檢測5種shRNA慢病毒載體的干擾

15、效率,并選取干擾效果最好的a5shRNA進行單克隆穩(wěn)定細胞株的篩選,篩選出細胞克隆a5-2的基因沉默效果最好,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞株a5-2的Oct4下調65％。所以選取a5-2作為研究Oct4機制功能檢測的基因沉默細胞株。
　　[結論]成功構建并篩選出Oct4過表達的穩(wěn)定細胞株和空載對照細胞株,以及Oct4基因沉默細胞株和對應的scramble對照細胞株。
　　二、Oct4對肝癌細胞生物學行為的影響
　　[目的]通過體外實驗

16、觀察Oct4過表達和基因沉默對HCC細胞凋亡、細胞增殖、運動、侵襲、粘附以及細胞轉化和抗化療能力的影響;通過體內實驗通過裸鼠人肝癌模型進一步驗證Oct4過表達對于HepG2成瘤能力的影響。
　　[方法]根據(jù)第一部分對HCC細胞系中Oct4蛋白表達情況的檢測結果,我們選取了Oct4基礎表達水平低的HepG2細胞和PLC/PRF,通過轉染Oct4表達質粒,獲得Oct4過表達細胞;選擇Oct4基礎表達水平高的HCCLM3,通過基因沉默阻

17、斷其表達,通過正反兩個方面研究其對細胞生物學行為的影響。采用ANNEXINV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、CyQUANT細胞增殖試劑盒、Matrigel膠和軟瓊脂克隆形成實驗分別比較Oct4過表達和基因沉默后肝癌細胞的細胞凋亡,細胞增殖、粘附、運動、侵襲能力及細胞轉化能力的變化;將Oct4過表達和空載對照的HepG2細胞穩(wěn)定細胞株(1×107/只)分別進行裸鼠皮下接種,每周兩次觀察并記錄裸鼠的成瘤情況;裸鼠皮下接種四周后,處死裸鼠進行拍

18、照;利用細胞增殖檢測Oct4對HCC化療藥物敏感性的影響。
　　[結果]流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),與對照相比,Oct4過表達和基因沉默的細胞其凋亡情況都沒有明顯的差異(P=0.24);Oct4過表達的HepG2細胞增殖能力明顯高于對照組(P＜0.001);而Oct4基因沉默的HCCLM3細胞,其增殖能力則明顯低于對照組(P＜0.001);Oct4過表達的HepG2細胞與對照組相比,細胞的運動能力和粘附能力無顯著差異。細胞侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)

19、Oct4過表達的細胞株穿過過人工基底膜的細胞數(shù)(150.2±10.1)明顯多于對照質粒組的HepG2穿膜的細胞數(shù)(62.3+8.4):Oct4過表達的HepG2細胞在軟瓊脂膠中形成的克隆數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05);在5-Fu作用下,Oct4過表達的穩(wěn)定細胞株的增殖能力明顯高于對照細胞,接近于無5-Fu無處理的細胞(P＜0.001)。
　　體內實驗發(fā)現(xiàn),和對照組相比,Oct4過表達組的裸鼠皮下瘤增長更快,其增長曲線明顯高于對照

20、組:腫瘤細胞裸鼠皮下接種第四周,對照組的裸鼠皮下瘤體積為1.769±0.235mm3,而Oct4過表達組0.589±0.18cm3,差異顯著(P=0.0011)
　　[結論]體外實驗表明,Oct4可以促進細胞增殖,增加細胞的侵襲和轉化能力,提高HCC細胞對化療藥物的抵抗能力;體內實驗表明,Oct4可以促進HepG2細胞在裸鼠皮下成瘤。
　　三、Oct4影響HCC細胞生物活性的機制研究
　　[目的]研究Oct4過表達對肝

21、癌干細胞標記物Epcam、Vimentin、ELF和KLF4、CD44和CD133表達的影響;研究Oct4過表達對HCC細胞抗藥性的影響;探討Oct4對腫瘤和干細胞相關信號通路(IL-6/survivin、TGF-beta/和Wnt/beta-catenin)的影響。
　　[方法](1)采用Werstemblot和Elisa實驗檢測腫瘤相關信號通路和干細胞相關信號通路的變化。(2)采用RT-PCR分析腫瘤干細胞相關因子的表達情況。

22、(3)采用流式細胞儀檢測CD44和CD133陽性的細胞。(4)利用Werstemblot檢測Oct4過表達的細胞與5-Fu抗性細胞信號通路的表達情況。
　　[結果](1)Western Blot檢測結果發(fā)現(xiàn)Oct4過表達后,磷酸化的AKT、JAK、stat3和ERK其表達水平明顯增高,Survivin、OPN以及beta-catenin的表達也是上調的,但是E-cadeherin的表達是下降的。(2)Elisa檢測了腫瘤相關分泌蛋

23、白的表達,發(fā)現(xiàn)IL-6、MPP2和MPP9的表達是上調的,TGF-beta的表達下調。(3)RT-PCR結果表明,Oct4過表達后,Vimentin、ELF和KLF4等干細胞因子的表達水平顯著升高。(4)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),Oct4過表達后,CDl33,CD44陽性的細胞明顯增加。(5)和對照細胞相比,Oct4過表達的細胞與5-Fu抗性細胞表達的主要信號分子是一致的。
　　[結論]Oct4可能通過上調干細胞相關信號通路,誘導生成更