Megsin及p38MAPK信號通路在糖尿病腎病發(fā)病機制中的作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥,是導致終末期腎衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因,如何早期有效防治DN已成為當今國內外學者熱切關注的課題。DN的發(fā)病機制非常復雜,長期以來認為是在以高血糖引起的糖脂代謝紊亂的基礎上,多種因素綜合作用的結果。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)炎癥及氧化應激在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。腎小球系膜細胞(glomeru

2、lar-mesangial eell,GMC)是腎臟重要的固有細胞(inherent cell)之一,在腎臟的組織結構和生理功能方面發(fā)揮著重要作用,具有產生細胞外基質、分泌細胞因子、吞噬和清除異物等多種功能。GMC也是多種致病因子作用的主要靶細胞,在病變進展中扮演著重要角色。Megsin是一種系膜細胞優(yōu)勢表達基因,其表達產物屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteaseinhibitor,serpin)超家族成員。Serpin家

3、族成員眾多,功能涉及凝血、纖溶、炎癥、細胞增殖、凋亡、信號轉導、消化等多個系統(tǒng)。Megsin可作用于其底物纖溶酶(plasmin)并抑制其活性,從而直接或間接抑制細胞外基質降解。研究表明,在IgA腎病、DN和大鼠抗Thy-1腎炎模型中megsin表達上升,提示megsin與系膜細胞增生和系膜外基質積聚密切相關。目前有關megsin具體生物學功能還很不清楚,其在DN中的作用機制鮮有深入研究報道。研究表明,高血糖、炎癥細胞因子、活性氧、血管

4、緊張素Ⅱ等均可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated Protein Kinase,p38MAPK)信號通路,它不僅參與細胞的存活、分化和凋亡等過程,還在炎癥、應激反應中具有重要作用,是細胞信息傳遞的交匯點或共同通路。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病時單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及細胞問黏附分子-1(ICAM-1)表達增多與p38MAPK通路激活密切相關。MCP-1及ICAM-1過度表達可介導大量巨噬細胞趨化和激活

5、,加重糖尿病腎損傷。DN時MCP-1和ICAM-1水平可作為衡量炎性反應程度的指標。糖尿病狀態(tài)下,腎組織中活性氧產生大量增加,導致脂質過氧化終產物丙二醛(MDA)生成增多,總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶活性下降,引起腎損害。腎素--血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的激活,是DN發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié),血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是

6、其主要效應分子。因此,抑制AngⅡ的產生并干擾其作用是DN治療的關鍵。纈沙坦是血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptorⅠ antagonist,AT1Ra),新近研究發(fā)現(xiàn)這類藥物具有一定的非依賴降壓的腎臟保護作用。
　　 本研究分別構建megsin質粒和megsin siRNA質粒,轉染CD-1小鼠和小鼠腎臟系膜細胞,從整體、細胞和分子水平系統(tǒng)觀察megsin、p38MAPK信號通路、炎癥因子MCP

7、-1、ICAM-1及氧化應激相關指標MDA、T-SOD、GSH-PX的變化,及其之間的相互關系,探討megsin參與早期DN發(fā)生的作用機制;并通過腎小球系膜細胞藥物干預實驗,觀察血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑纈沙坦對megsin表達及p38MAPK信號通路活化的影響,探討纈沙坦腎臟保護作用的機制,最終為篩選從基因或蛋白水平阻斷megsin致病作用的有效途徑,進一步闡明DN發(fā)病的分子學機制及其防治提供一條新思路。
　　 方法:

8、　　 第一部分:健康雄性CD-1小鼠48只,戊巴比妥鈉腹腔麻醉(5mL/kg)后行左腎切除術,2周后切口完全愈合。小鼠隨機分為兩組:左腎切除對照組(CN,n=24)和糖尿病組(DM,n=24)。其中DM組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,150 mg/kg溶于0.1mol/L枸椽酸緩沖液中,pH值4.5),CN組只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液,72h后尾尖取血,血糖儀測定血糖,尿糖試紙測定尿糖,血糖≥16.7

9、mmol/L,尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型。分別于注射STZ后1、2、4和12周末每組取6只小鼠,收集血、尿和腎組織標本,測定血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(serumcreatinine,Scr)、腎重/體重比值(Kidney weight/body weight ratio,KW/BW)、24h尿蛋白(Urinary protein,UP);光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變,免疫組織化學染色和Westem bl

10、ot檢測腎組織megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表達。
　　 第二部分:構建megsin表達質粒和megsin siRNA質粒。選擇CD-1小鼠共30只,經單側腎切除后,隨機選取6只作為正常對照組(A組,n=6),其余24只一次性腹膜腔注射STZ(150mg/kg),制備糖尿病模犁,成模后隨機選取6只作為糖尿病組(B組,n=6),剩余18只經尾靜脈分別注射空質粒,megsin質粒和m

11、egsin siRNA質粒,每周1次,分別為(CN、D組、E組,各組n=6),實驗共4周。于第4周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標本,測定BG、Scr、KW/BW、UP,光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變,免疫組化和Western blot檢測腎組織megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1、ICAM-1蛋白表達,分別應用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定腎組織中脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量

12、及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性的變化。
　　 第三部分:用含10％胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞,傳代后接種于96孔板,無血清培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h。用MTT法觀察不同時間(12、24、48h)高糖及megsin對細胞增殖狀態(tài)的影響。將系膜細胞分為5組:低糖組(A組,非轉染的系膜細胞,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖組(B

13、組,非轉染的系膜細胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+空質粒組(C組,轉染空質粒的系膜細胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+megsin轉染組(D組,穩(wěn)定表達megsin的系膜細胞,30mmol/L葡萄糖)和高糖+megsin siRNA轉染組(E組,脂質體2000轉染megsin siRNA質粒,30mmol/L葡萄糖)。分別在6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)12、24和48小時末收集細胞,提取細胞總蛋白及細胞上清液。應

14、用免疫細胞化學和western blot測定各組總蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1的表達,分別應用硫代巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定細胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中Ⅳ型膠原含量。
　　 第四部分:取小鼠系膜細胞種植于96孔板,采用MTT法分別檢測低糖、高糖以及干預藥物纈沙坦在不同時間、

15、不同藥物濃度對系膜細胞增殖狀態(tài)的影響。采用6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞,將細胞分成3組:LG組(5.5mmol/L葡萄糖);HG組(30mmol/L葡萄糖)和HG+Val組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L纈沙坦),于刺激的48h收集細胞,提取細胞總蛋白及細胞上清液。采用免疫細胞化學和Western blot檢測各組總蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表達,分別應用硫代

16、巴比妥酸(TAB)法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法測定細胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中IV型膠原含量。
　　 結論:
　　 1體內和體外實驗證實,糖尿病狀態(tài)下megsin在腎小球表達增強,伴有腎小球系膜增殖、細胞外基質積聚等腎臟病理改變,提示megsin在糖尿病腎病發(fā)生機制中起一定作用。
　　 2過表達megsin可上調腎組織或系膜細胞p-

17、p38MAPK、MCP-1、ICAM-1的表達及MDA含量,降低T-SOD、GSH-PX的活性,促進腎小球系膜細胞增牛及系膜外基質沉積,提示megsin促發(fā)早期糖尿病腎病發(fā)生的機制可能與p38MAPK信號通路激活有關,但具體作用途徑有待進一步研究闡明。
　　 3 megsin siRNA質粒和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦可分別從基因水平和蛋白水平下調megsin的表達,進而抑制p38MAPK信號通路激活,下調MCP-1、ICAM