缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及miRNA相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景：游離皮瓣移植（Free Skin Flap Grafting，SGF）是整形外科修復(fù)組織缺損畸形和器官再造的重要手段和方法。缺血再灌注（Ischemic Reperfusion，I/R）是組織游離移植過程中不可避免的病理過程，在對發(fā)生血管危象皮瓣進(jìn)行探查及二次吻合的過程中，缺血再灌注損傷更為常見，嚴(yán)重影響皮瓣的成活率和存活質(zhì)量。在缺血再灌注損傷治療研究領(lǐng)域，缺血后處理（Ischemic Postconditioning，IPo）和

2、遠(yuǎn)程缺血后處理（Remote Ischemic Postconditioning，RIPo）是目前基礎(chǔ)及臨床工作關(guān)注的熱點(diǎn)。在對心、腦、脊髓、肺、腎等再灌注模型的研究中，IPo及RIPo對組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用逐漸被證實(shí)，部分的研究成果已被應(yīng)用于臨床缺血再灌注的預(yù)防和治療，但其具體的作用機(jī)制至今尚不清晰。miR-21是近年來被發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷過程中具有重要保護(hù)作用的miRNA。既往研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1a（Hypoxia

3、 Inducible Factor-1a，Hif-1a）能夠在缺氧早期促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá)，后者能夠通過靶向抑制其下游的促凋亡基因起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　目的：本研究擬通過構(gòu)建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型，探討原位缺血后處理和遠(yuǎn)程肢體缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，以及對Hif-1a蛋白和一系列組織缺氧相關(guān)miRNA的表達(dá)調(diào)控。在體外實(shí)驗(yàn)中，研究擬采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H202）作為

4、外源性自由基生成系統(tǒng)，建立體外血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）氧化應(yīng)激損傷模型，探討miR-21過表達(dá)對VSMC在氧化損傷中的抗凋亡作用，及其對凋亡誘導(dǎo)蛋白PTEN的表達(dá)調(diào)控。同時，通過對臨床游離皮瓣缺血及再灌注組織樣本的檢測，研究擬進(jìn)一步明確miRNA表達(dá)與人體皮瓣缺血再灌注損傷的相關(guān)性。
　　方法：1.構(gòu)建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型：①設(shè)計以腹壁淺動脈為蒂的大鼠腹壁島狀瓣模

5、型，按缺血時間（0小時，4小時，6小時，8小時，12小時）將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組；②硫代巴比妥酸法再灌注24小時檢測各組皮瓣組織中丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法檢測各組皮瓣組織中氧化物歧化酶（SOD）活性；③再灌注第7天分析皮瓣成活區(qū)域和壞死區(qū)域面積，計算皮瓣存活率；④實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time RT-PCR）檢測缺血8小時，再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，Rno-miR-1，Rno-miR-

6、133，Rno-miR-210，Rno-miR-21，Rno-miR-200c及 Rno-miR-92a在大鼠皮瓣及血管組織內(nèi)的表達(dá)；2.體內(nèi)研究缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：①設(shè)計以腹壁淺動脈為蒂的大鼠腹壁島狀瓣缺血再灌注模型，將40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），對照組（NC組），缺血后處理組（Isc組），遠(yuǎn)程肢體缺血后處理組（Rem-Isc組），每組10只；②硫代巴比妥酸法檢測再灌注24小時各組皮瓣組織MDA

7、含量，黃嘌呤氧化酶法檢測各組皮瓣組織SOD活性；③免疫組化法（IHC）檢測再灌注第3天各組皮瓣組織內(nèi)Hif-1a蛋白表達(dá)；④免疫印跡法（Western Blot）檢測再灌注第3天及第7天血管組織內(nèi)Hif-1a蛋白表達(dá)；⑤實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time RT-PCR）檢測再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，Rno-miR-21及 Rno-200c在大鼠皮瓣及血管組織內(nèi)的表達(dá)；⑥再灌注第7天對大鼠皮瓣進(jìn)行拍攝，測量各

8、組皮瓣成活區(qū)域和壞死區(qū)域面積，計算皮瓣存活率；3.體外研究miR-21對血管平滑肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用：①組織貼塊法培養(yǎng)原代大鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC），免疫熒光鑒定平滑肌標(biāo)志蛋白 a-Actin表達(dá)，體外構(gòu)建過氧化氫（H202）誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型；②通過 lipofectine2000?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 miR-21模擬物以及miR-21抑制劑，在VSMC內(nèi)過表達(dá)miR-21或抑制miR-21表達(dá)；實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組：NC組；H202

9、組；miR-21 mimics+ H202組；NC1 mimics+ H202組； miR-21 inhibitor+H202組；NC2+H202組；miR-21 mimics組；NC1 mimics組；miR-21 inhibitor組；miR-21 inhibitor組；③ CCK-8法檢測VSMCs處理后24小時和48小時細(xì)胞活力；④ Western Blot檢測處理后48小時各組細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白、Pre-CASP3蛋白以及cl

10、eaved-CASP3蛋白表達(dá);⑤免疫熒光鑒定VSMCs處理后24小時細(xì)胞內(nèi)a-Actin蛋白表達(dá)；⑥ PI/HO染色鑒定VSMCs處理后24小時細(xì)胞凋亡率；4.游離皮瓣乳房重建術(shù)患者相關(guān)數(shù)據(jù)分析：①分別于術(shù)前及術(shù)后6月對126名游離皮瓣乳房重建患者進(jìn)行 RSES、PHQ-9、GAD-7等自我評估量表檢測，并對結(jié)果進(jìn)行比較分析；②術(shù)中采集6名行游離腹壁下動脈穿支皮瓣（DIEP）乳房重建術(shù)患者的正常（N組）、缺血（I組）及再灌注后（R組）

11、DIEP皮瓣邊緣組織樣本，real-time RT-PCR檢測組織中miR-210，miR-21，miR-200c及miR-92a相對表達(dá)。
　　結(jié)果：1.構(gòu)建大鼠腹壁皮瓣缺血再灌注模型：①術(shù)后第7天，缺血0小時組、4小時組、6小時組、8小時組、12小時組的皮瓣存活面積依次為98.1±1.6%、92.6±7.4%、87.1±14.0%、54.6±13.4%、24.2±11.1%。方差分析結(jié)果顯示，各組皮瓣存活面積具有顯著性差異（P

12、<0.05）；②再灌注24小時各組皮瓣組織內(nèi)MDA含量依次為38.0±5.8 nmol/g、72.9±17.0 nmol/g、103.8±10.9 nmol/g、171.7±4.7 nmol/g、165.1±10.5 nmol/g，皮瓣組織中 SOD活性依次為93.2±12.8 U/g、76.9±9.9 U/g、56.7±7.3 U/g、37.6±6.0 U/g、26.1±6.5 U/g；方差分析結(jié)果顯示，各組皮瓣組織中MDA含量及SO

13、D活性均具有顯著性差異（P<0.05）；③與缺血前相比，血管組織及皮瓣組織內(nèi) Rno-miR-21和Rno-miR-200c在缺血再灌注再灌注2小時，再灌注12小時，再灌注24小時，表達(dá)均顯著升高；2.缺血后處理對皮瓣缺血再灌注損傷保護(hù)作用的體內(nèi)研究：①與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注第7天皮瓣存活面積顯著升高（P=0.034，P=0.049）；②與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注24小時皮瓣組織內(nèi)MDA含量顯

14、著下降（P=0.011，P=0.014），SOD活性顯著升高（P=0.020，P<0.01）；③免疫組化結(jié)果顯示，與NC組相比，Isc組與Rem-Isc組再灌注第3天皮瓣組織內(nèi)Hif-1a蛋白陽性表達(dá)顯著升高；④ Western Blot結(jié)果顯示再灌注第3天與第7天，Isc組皮瓣血管組織Hif-1a蛋白表達(dá)與NC組相比均顯著升高（P<0.01，P<0.01）；Rem-Isc組皮瓣血管組織Hif-1a蛋白表達(dá)與NC組相比均顯著升高（P<0

15、.01，P<0.01）；⑤與NC組相比，再灌注24小時內(nèi)，Isc組與Rem-Isc組皮瓣組織及血管蒂組織內(nèi)Rno-miR-21表達(dá)均顯著升高；與NC組相比，Isc組血管蒂組織內(nèi)Rno-miR-200c僅在再灌注12小時后表達(dá)上調(diào)，Rem-Isc組則無明顯改變；3.體外研究 miR-21對血管平滑肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用：①與NC組相比，H202組VSMC細(xì)胞內(nèi)α-actin蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01）；與NC1+H202組比較，mi

16、R-21 mimics+H202組VSMC細(xì)胞內(nèi)α-actin蛋白表達(dá)呈一定程度的升高趨勢，但差異無顯著性（P=0.073）；與NC2+H202組比較，miR-21 inhibitor+H202組VSMC細(xì)胞內(nèi)α-actin蛋白表達(dá)量顯著下降（P=0.049）；② Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，H202組VSMC細(xì)胞Pro-CASP3、cleaved CASP3蛋白表達(dá)顯著增高（P=0.011，P<0.01），PTEN

17、蛋白表達(dá)量下降（P=0.028）；與NC1+H202組比較，miR-21 mimics+H202組細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)量顯著下降（P<0.01），Pro-CASP3蛋白表達(dá)無明顯改變，cleaved CASP3蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.014）；與NC2+ H202組比較，miR-21 inhibitor+ H202組VSMC細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.01），Pro-CASP3蛋白表達(dá)無明顯改變，cleaved CAS

18、P3蛋白表達(dá)顯著增高（P=0.027）；③ CCK-8結(jié)果顯示：H202組細(xì)胞培養(yǎng)孔450 nm24小時與48小時OD值均顯著低于NC組（P<0.01，P<0.01）；miR-21mimics+H202組在24小時與NC1 mimics+H202組相比450 nm OD值沒有顯著改變，48小時OD值較NC1 mimics+H202組顯著增高（P=0.013）；miR-21 inhibitor+H202組在24小時與NC2 inhibit

19、or+H202組相比450 nm OD值沒有顯著改變，48小時OD值較NC2 inhibitor+H202組顯著降低（P=0.016）；⑤與NC組相比，H202組VSMC細(xì)胞核PI染色比例顯著升高（P<0.01）；與NC1+H202組比較，miR-21 mimics+H202組VSMC細(xì)胞核PI染色比例顯著下降（P=0.048）；4.游離皮瓣乳房重建患者臨床數(shù)據(jù)分析：①與術(shù)前相比，游離皮瓣乳房重建術(shù)后患者平均RSES評分顯著升高（P<0

20、.01），PHQ-9平均評分顯著降低（P<0.01），GAD-7平均評分無明顯改變；②術(shù)后6個月隨訪結(jié)果提示，DIEP游離皮瓣乳房重建患者Alderman滿意度評分為27.6±6.3分，切術(shù)后RSES評分（P<0.01）、術(shù)后RESE評分改變值（P<0.01）、術(shù)后GAD-7評分（P<0.01）以及術(shù)后GAD-7評分改變值（P<0.01）與Alderman評分線性相關(guān)；③與正常皮瓣組織相比，缺血90分鐘后人體皮瓣組織中 miR-21，m

21、iR-210，miR-92a、miR-200c的表達(dá)均無顯著性差異；與正常皮瓣組織相比，再灌注90分鐘后皮瓣組織中miR-21(P=0.02)，miR-200c(P=0.03)表達(dá)顯著上調(diào)，miR-210，miR-92a表達(dá)無顯著性差異。
　　結(jié)論：①缺血后處理和遠(yuǎn)程肢體缺血后處理能夠減輕缺血再灌注后氧自由基對皮瓣的損傷，增加缺血后皮瓣存活面積；② Hif-1蛋白表達(dá)及miR-21的表達(dá)上調(diào)可能參與了缺血后處理和遠(yuǎn)程肢體缺血后處理