硫氧還蛋白-1對(duì)缺血再灌注皮瓣的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:皮瓣缺血再灌注損傷是游離皮瓣移植不可避免的并發(fā)癥，也是術(shù)后組織血運(yùn)障礙、水腫以及壞死等并發(fā)癥發(fā)生的主要原因。目前研究認(rèn)為皮瓣缺血再灌注損傷與組織內(nèi)活性氧物質(zhì)爆發(fā)而導(dǎo)致的廣泛的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是廣泛分布于機(jī)體各組織細(xì)胞中的生命基礎(chǔ)蛋白，對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的維持和細(xì)胞凋亡分子通路的調(diào)控具有重要意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)trx1基因與皮膚組織對(duì)缺氧的耐受能力有關(guān)。因此，本研究通

2、過臨床組織標(biāo)本檢測、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討和研究Trx-1對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用、分子機(jī)制、預(yù)后意義和治療價(jià)值。
　　方法:1、對(duì)10名接受游離皮瓣移植手術(shù)的患者采取缺血再灌注皮瓣組織標(biāo)本，以自身正常全層皮膚組織作對(duì)照，分別應(yīng)用TUNEL染色和免疫組織化學(xué)染色檢測臨床組織標(biāo)本中細(xì)胞凋亡程度和Trx-1表達(dá)量，并通過線性回歸分析二者之間的相關(guān)關(guān)系。
　　2、構(gòu)建CoCl2誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCAT)化學(xué)缺氧

3、模型，應(yīng)用Wenstern blot檢測和分析缺氧環(huán)境下細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況和重組人Trx-1蛋白對(duì)缺氧細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。
　　3、構(gòu)建小鼠缺血再灌注皮瓣模型，觀察再灌注7日內(nèi)皮瓣存活率的差異，并應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色、SOD活力測定、MDA含量測定以及Wenstern blot研究體內(nèi)環(huán)境中Trx-1對(duì)缺血再灌注皮瓣的保護(hù)作用、分子機(jī)制和預(yù)后意義，以及重組人Trx-1蛋白對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷的治療

4、價(jià)值。
　　結(jié)果:1、臨床缺血再灌注皮瓣組織標(biāo)本內(nèi)細(xì)胞凋亡程度明顯升高(p＜0.01)，同時(shí)Trx-1表達(dá)量明顯降低(p＜0.01)，并且二者呈現(xiàn)高度線性負(fù)相關(guān)(r2=0.89，p＜0.01)。
　　2、缺氧環(huán)境能夠?qū)е翲aCAT細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達(dá)量明顯降低(p＜0.01)，并上調(diào)ASK-MAPK凋亡信號(hào)通路蛋白ASK1、p-p38以及凋亡標(biāo)志蛋白c-PARP的表達(dá)(p＜0.01)。
　　3、應(yīng)用重組人Trx-1蛋白

5、預(yù)防性孵育HaCAT細(xì)胞能夠提高細(xì)胞內(nèi)Trx-1表達(dá)水平(p＜0.01)，并顯著降低凋亡相關(guān)蛋白HIF-1α、p-p38和c-PARP的表達(dá)(p＜0.05)。
　　4、在沒有藥物干預(yù)的情況下，小鼠缺血再灌注皮瓣內(nèi)細(xì)胞凋亡程度明顯升高(p＜0.01)，同時(shí)Trx-1表達(dá)量明顯降低(p＜0.01)，并且二者呈現(xiàn)高度線性負(fù)相關(guān)(r2=0.93，p＜0.01)。
　　5、預(yù)防性全身應(yīng)用重組人Trx-1蛋白能夠減輕皮瓣缺血再灌注相關(guān)的

6、病理損傷，顯著提高小鼠缺血再灌注皮瓣的存活率(p＜0.01)。
　　6、小鼠缺血再灌注皮瓣中SOD活力顯著下降，而MDA含量顯著升高，與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);重組人Trx-1蛋白給藥后，皮瓣內(nèi)SOD活力明顯升高，MDA含量明顯下降，與非給藥組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　7、小鼠缺血再灌注皮瓣組織內(nèi)的Trx-1表達(dá)量顯著下降(p＜0.01)，同時(shí)ASK-MAPK凋亡信號(hào)通路蛋白AS

7、K1、p-p38以及凋亡標(biāo)志蛋白cl-caspase3的表達(dá)量顯著升高(p＜0.01);預(yù)防性全身應(yīng)用重組人Trx-1蛋白能夠提高皮瓣組織內(nèi)Trx-1的含量(p＜0.01)，并且下調(diào)ASK-MAPK細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白ASK1、p38的磷酸化水平和凋亡關(guān)鍵酶caspase3的剪切激活(p＜0.01)。
　　結(jié)論:1、Trx-1對(duì)缺血再灌注皮瓣和缺氧角質(zhì)形成細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用。
　　2、Trx-1的保護(hù)作用是通過直接清除活