人心肌特異表達(dá)新激酶TNNI3K的大鼠同源基因克隆及相關(guān)腺病毒載體構(gòu)建.pdf

1、研究背景與目的：
　　 TNNI3K基因是人心肌特異表達(dá)的新激酶，進(jìn)一步研究應(yīng)在人心肌細(xì)胞中展開，但沒有人源心肌細(xì)胞系可用，只有在乳鼠心肌細(xì)胞中，通過研究同源基因大鼠TNNI3K作為激酶到底通過哪條磷酸化通路參與心肌肥厚，來揭示人TNNI3K心肌特異表達(dá)的真正意義。面臨的問題是，課題組尚無用于后續(xù)功能研究的大鼠TNNI3K基因克隆。因此，本研究的首要任務(wù)是克隆大鼠TNNI3K基因，篩選RNA干擾的有效靶點(diǎn)，構(gòu)建該基因的過表達(dá)和R

2、NA干擾腺病毒重組體，為在大鼠心肌細(xì)胞中研究TNNI3K參與心肌肥厚打下基礎(chǔ)。
　　 方法和結(jié)果：
　　 1.生物信息學(xué)方法確認(rèn)大鼠TNNI3K基因的序列。分段擴(kuò)增大鼠TNNI3K基因片段，經(jīng)酶切連接克隆到T/A載體中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到大鼠TNNI3K基因的全部編碼區(qū)。2.設(shè)計(jì)合成4個(gè)shRNA干擾片段，干擾質(zhì)粒和重組表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T，WesternBlot和Real-timePCR方法分別檢驗(yàn)干擾效率，篩

3、選出rTNNI3K基因RNA干擾的有效靶點(diǎn)：+880～+898位，抑制效率達(dá)到90％，并構(gòu)建了RNA干擾的腺病毒重組體。3.大鼠TNNI3K基因克隆到腺病毒的穿梭質(zhì)粒中，通過同源重組，得到腺病毒TNNI3K重組體質(zhì)粒，在293細(xì)胞中制備出腺病毒rTNNI3K重組體。4.WesternBlot的方法檢測(cè)過表達(dá)和RNA干擾對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞JNK、p38和Erk磷酸化水平的影響。初步的結(jié)果顯示，無論是rTNNI3K過表達(dá)還是RNA干擾，都能激活