大鼠5-HT-,5A-受體基因siRNA重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、背景與目的： 5-羥色胺5A受體是5-羥色胺受體家族中的一個(gè)亞型，是主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種G蛋白偶聯(lián)受體。在對小鼠、大鼠和人mRNA的定位研究顯示5-HT5A受體mRNA在腦組織中廣泛表達(dá)，但在外周組織的表達(dá)很低甚至不表達(dá)。5-HT5A受體的分布區(qū)域與認(rèn)知、焦慮的調(diào)節(jié)、感覺的形成、神經(jīng)內(nèi)分泌、運(yùn)動(dòng)的整合、晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)及疼痛的調(diào)控有關(guān)。雖然5-HT5A受體被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過10年，但是目前國內(nèi)外少有對5-HT5A受體功能的深入

2、研究。這主要是因?yàn)槿狈︶槍?-HT5A受體的高選擇性配體和拮抗劑，因此很難界定5-HT5A受體在生理和病理過程中所發(fā)揮的作用。因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了以5-HT5A受體基因?yàn)榘袠?biāo)的siRNA表達(dá)載體，并觀察其在大鼠神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)，為在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步研究該受體的功能提供了技術(shù)支持。 研究方法： 1.設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對5-HT5A受體mRNA的3條siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr

3、5a2、pGenesil-2 Htr5a3和一條無關(guān)對照序列表達(dá)載體pGenesil-2 HK，同時(shí)還構(gòu)建了一條攜帶有5-HT5A受體全長基因并同時(shí)表達(dá)紅色和綠色熒光蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體pDsRed-EGFP-Htr5a。分別將pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3、pGenesil-2 HK質(zhì)粒表達(dá)載體與pDsRed-EGFP-Htr5a質(zhì)粒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，4

4、8小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞篩選，通過用Red紅色熒光做對照，EGFP綠色熒光為主要熒光，看干擾序列對EGFP的減弱程度，從而鑒定出相應(yīng)的干擾序列對基因的干擾效果，對EGFP減弱程度越明顯，說明干擾效果越明顯。 2.將篩選出的pGenesil-2 Htr5a2表達(dá)載體中的Htr5a2表達(dá)框亞克隆至pGenesil1.2構(gòu)建pGenesil1.2 Htr5a2質(zhì)粒表達(dá)載體，然后將pGenesil1.2 Htr5a2與pGSadeno腺病毒

5、表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，構(gòu)建pGSadeno Htr5a2重組腺病毒表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝出毒并進(jìn)一步放大培養(yǎng)以獲得需要的病毒量。將收獲的pGSadeno Htr5a2重組腺病毒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)細(xì)胞，48小時(shí)后用RT-PCR技術(shù)檢測各組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)5-HT5A受體mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切鑒定及DNA測序，重組質(zhì)粒中已插入了目的基因片段。經(jīng)流式細(xì)胞檢測，通過比較GFP平均熒光強(qiáng)度與RFP平均

6、熒光強(qiáng)度的比值，就能篩選出最有效的序列。其中pGenesil-2 Htr5a2的GFP平均熒光強(qiáng)度/RFP平均熒光強(qiáng)度的值為0.39，pGenesil-2 Htr5al的值為0.539，pGenesil-2 Htr5a3的值為0.417，pGenesil-2 HK的值為1.626，由此可知pGenesil-2 Htr5a2能有效抑制5-HT5A受體基因的表達(dá)。 2.通過酶切鑒定，證明了目的基因片段正確插入了pGSadeno腺病毒

7、載體中。由于pGSadeno Htr5a2重組腺病毒中有綠色熒光蛋白真核表達(dá)框，因此在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后如果出現(xiàn)明顯的綠色熒光蛋白表達(dá)，則說明有感染能力的重組腺病毒包裝成功，而且經(jīng)測定腺病毒滴度達(dá)到109 pfu/ml。將pGSadeno Htr5a2重組腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞后24小時(shí)可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，48小時(shí)后經(jīng)RT-PCR技術(shù)檢測pGSadeno Htr5a2重組腺病毒能有效抑制5-HT5A受體mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：

8、 1.成功構(gòu)建了和鑒定了針對5-HT5A受體基因的RNA干擾重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3，并發(fā)現(xiàn)pGenesil2-Htr5a2能有效抑制外源性5-HT5A受體基因在293細(xì)胞中的表達(dá)，從而篩選出最有效的重組質(zhì)粒表達(dá)載體，為下一步構(gòu)建針對5-HT5A受體基因的siRNA重組腺病毒表達(dá)載體做好了準(zhǔn)備。 2.成功構(gòu)建了和鑒定了針對5-H