TNNI3K基因表達(dá)與心肌肥厚形態(tài)學(xué)變化的相關(guān)性研究.pdf

1、心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)多種損害心臟泵功能的病理性刺激的一種代償性反應(yīng),藉此代償性增加心臟的泵血功能。這些刺激信號(hào)可分為三類:力學(xué)信號(hào)、神經(jīng)激素信號(hào)和細(xì)胞因子信號(hào)。如這些病理性刺激不能被及時(shí)去除,最終可致使心肌組織發(fā)生嚴(yán)重的病理改變,心功能受損,以至于心功能衰竭。因此,心肌肥厚的機(jī)制研究一直為心血管研究的熱點(diǎn)。
　　 TNNI3K(cTnI-interacting kinase)是在心臟特異性表達(dá)的心肌激酶基因,它可能與心肌肌鈣蛋白

2、Ⅰ和心肌肌動(dòng)蛋白等肌小節(jié)收縮調(diào)節(jié)蛋白的功能有關(guān),并可能通過一條未知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了對(duì)肌小節(jié)收縮蛋白的調(diào)控,進(jìn)而調(diào)控心肌收縮能力。因此TNNI3K可能在超負(fù)荷心肌肥厚的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第一部分:TNNI3K在大鼠壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型的表達(dá)
　　 目的:觀察在心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展過程中心臟的結(jié)構(gòu)變化,及與TNNI3K的表達(dá)的相關(guān)性。
　　 方法:選用190-200g的成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為:

3、①假手術(shù)對(duì)照組(Con):2周(Con2W)、4周(Con4W)、6周(Con6W);②模型組(Mod):2周(Mod2W)、4周(Mod4W)、6周(Mod6W)。大鼠壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型的制備參考Anversa P的方法。假手術(shù)對(duì)照組只分離左腎動(dòng)脈上方的腹主動(dòng)脈,并不結(jié)扎。其他步驟與模型組相同。
　　 1 HE染色觀察心肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　 將實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后處死,取其心臟并將左心室分成兩部分,一部分放入4％多聚甲醛固定

4、液內(nèi)固定。常規(guī)石蠟切片HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)變化,日本產(chǎn)Nikon光學(xué)顯微鏡下拍照。
　　 2電鏡觀察左心室的超微結(jié)構(gòu)變化
　　 將另一部分左心室標(biāo)本放入3％多聚甲醛和1％戊二醛混合固定液中固定。用于電鏡觀察左心室的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 3免疫組織化學(xué)染色法觀測(cè)TNNI3K基因表達(dá)變化
　　 將HE染色后剩余標(biāo)本常規(guī)石蠟切片,做免疫組織化學(xué)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察,日本產(chǎn)Nikon光學(xué)顯微鏡下拍

5、照,并用圖像處理軟件(ImageProPlus6.0)進(jìn)行圖像分析。
　　 結(jié)果:
　　 腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后2至6周,血流動(dòng)力學(xué)和心臟重量指數(shù)均發(fā)生相應(yīng)的變化,此外術(shù)后4-6周時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠左心室腔直徑為7.38±0.43mm較對(duì)照組7.14±0.33mm略有增加,但左室壁厚則由3.8±0.45mm增至5.89±0.23mm,左心室的室壁厚度與室腔直徑之比大于對(duì)照組,表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生向心性肥厚。
　　 1左心室壁的

6、組織學(xué)變化
　　 各對(duì)照組心肌纖維排列整齊,細(xì)胞的平均直徑為9.7～9.9μm,胞核的平均直徑為2.30～2.39μm。2周模型組的心肌細(xì)胞彌漫性肥大,其胞體平均直徑為15.19±2.24μm,核深染,其平均直徑為3.39±0.87μm。4周模型組的心肌細(xì)胞較2W更加肥大,其胞體平均直徑為15.72±1.62μm,核的平均直徑為3.46±0.16μm;心肌纖維走行紊亂,肌纖維間隙增寬,并可見間質(zhì)纖維化。6周模型組,心肌細(xì)胞進(jìn)一步

7、肥大,其胞體平均直徑為16.08±2.69μm,核的平均直徑為3.65±0.15μm,肌纖維走行紊亂、斷裂,間質(zhì)纖維化嚴(yán)重。
　　 2大鼠左心室壁的超微結(jié)構(gòu)變化
　　 各對(duì)照組大鼠心肌原纖維排列整齊,明帶、暗帶、Z線及閏盤清晰,肌節(jié)長(zhǎng)約1.63μm。線粒體分布在心肌原纖維之間,多為橢圓形,呈串珠狀排列,線粒體嵴清晰呈板層狀排列,較稀疏。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后2周時(shí):心肌原纖維整齊,閏盤和肌節(jié)清晰,肌節(jié)長(zhǎng)1.83±0.08μm;

8、線粒體逐漸增多,并出現(xiàn)集結(jié)現(xiàn)象,集結(jié)處線粒體多呈圓形,線粒體嵴排列密集;間質(zhì)中微血管擴(kuò)張,周細(xì)胞的胞核染色質(zhì)凝聚成塊狀,并邊聚化,提示早期凋亡。術(shù)后4周時(shí):肌節(jié)長(zhǎng)度與2周近似,長(zhǎng)1.85±0.01μm。但線粒體集結(jié)現(xiàn)象增強(qiáng),集結(jié)處線粒體數(shù)量增多,排列密集,線粒體嵴的形狀和排列與2周組近似;細(xì)胞間質(zhì)中除可見微血管擴(kuò)張及早期凋亡的周細(xì)胞外,還可見晚期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核皺縮,其染色質(zhì)凝聚,邊聚化,出現(xiàn)凋亡小體。術(shù)后6周組時(shí):肌節(jié)增長(zhǎng)至1.94±

9、0.09μm,線粒體集結(jié)處出現(xiàn)排列疏松區(qū),線粒體嵴逐漸密集,線粒體嵴較其它組增厚;可以觀察到死亡的心肌細(xì)胞,其胞膜崩解,大部細(xì)胞器溶解,可見少量外形完整的圓形線粒體,細(xì)胞核皺縮,染色質(zhì)凝聚,并邊聚化。
　　 3 TNNI3K基因的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)分析表明,2、4、6周各對(duì)照組心肌組織的TNNI3K基因的蛋白表達(dá)近似,其平均光密度為0.16 OD。腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后2周時(shí),TNNI3K基因的蛋白表達(dá)略低于對(duì)照組,但無

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其平均光密度為0.15±0.04 OD。術(shù)后4～6周時(shí),TNNI3K基因的蛋白表達(dá)逐步增強(qiáng),其平均光密度分別為0.17±0.02 OD和0.20±0.04 OD。
　　 結(jié)論:
　　 1腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)成功制備大鼠壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型。
　　 2隨著心肌肥厚的出現(xiàn)及進(jìn)展,間質(zhì)纖維化逐漸加重,細(xì)胞凋亡增加。
　　 3 TNNI3K基因的可能在心肌肥厚的中后期發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分

11、:TNNI3K基因在乳鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的:觀察AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞的形態(tài)影響及與TNNI3K基因表達(dá)的相關(guān)性。
　　 方法:取新生72小時(shí)內(nèi)的SD仔鼠的心臟,應(yīng)用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)心肌細(xì)胞,制備細(xì)胞爬片。24h后換為無血清培養(yǎng)基,24h后實(shí)驗(yàn)組中加入AngⅡ(10μmol/L),對(duì)照組加入PBS,繼續(xù)培養(yǎng)4天。之后以95％乙醇固定20min,細(xì)胞免疫化學(xué)染色,顯微照相。應(yīng)用(ImageProPlus6

12、.0)軟件分析圖像,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大,其平均直徑為42.48±1.91μm,面積為1546.428±633.61μm2,未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的平均直徑為35.81±2.36μm,面積為1032.672±334.35μm2。提示AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型成功。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色,光密度分析顯示,模型細(xì)胞中TNNI3K基因的蛋白表達(dá)增強(qiáng),其累積光密度為202.86±74.40 OD。而