SIPA1通過下調(diào)Rap1-ERK通路抑制HCC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移.pdf

1、一肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是當(dāng)前嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的最主要惡性腫瘤之一。隨著肝臟外科技術(shù)以及麻醉與圍手術(shù)期處理水平的進(jìn)步，肝癌的手術(shù)切除率顯著提高，在一些大的肝臟外科中心肝癌手術(shù)死亡率已接近為零。盡管如此，以5年生存率為標(biāo)志的肝癌整體治療水平仍無顯著改善，究其原因在于肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌切除術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率高于60％，小肝癌也在40％以上。顯然，肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移已成

2、為嚴(yán)重制約肝癌患者長(zhǎng)期存活的關(guān)鍵因素。因此，深入研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制，積極探索有效的抗復(fù)發(fā)治療措施是當(dāng)前肝癌診治中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，對(duì)于進(jìn)一步改善肝癌患者長(zhǎng)期存活率具有重要意義。
　　 已有的研究證實(shí)，SIPA1(Signal-induced Proliferation-associated Gene1，信號(hào)誘導(dǎo)的增殖相關(guān)基因1)在血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了非常重要的作用。新近的研究表明小鼠sipal是決定小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移傾向

3、的重要基因。眾所周知，肝臟是胚胎時(shí)期的重要造血器官，血細(xì)胞(如血小板)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。根據(jù)以上的研究結(jié)果我們推測(cè)SIPA1基因很可能在HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，本課題在研究SIPA1在臨床肝癌病例及肝癌細(xì)胞系中表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)SIPA1的表達(dá)，并綜合利用一系列體外、體內(nèi)方法研究SIPA1調(diào)控HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。我們獲得了如下研究結(jié)果：
　　 1.我們首先采用RT-PCR和We

4、stern blot等方法檢測(cè)了SIPA1 mRNA和蛋白在30例新鮮HCC組織及相應(yīng)鄰近非癌肝組織(ANLT)中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與ANLT比較，SIPA1 mRNA和蛋白水平在癌組織中表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，且肝癌組織中SIPA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)(r=0.757，p<0.001)。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示ANLT中SIPA1 mRNA表達(dá)量為癌組織的4.17倍。進(jìn)而，我們采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了1

5、30例HCC組織中SIPA1的表達(dá)，結(jié)果顯示SIPA1主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，其在癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率為62.3％(81/130)。肝癌組織中SIPA1低表達(dá)與腫瘤多結(jié)節(jié)，分化差及靜脈侵襲密切相關(guān)(p<0.05)。SIPA1陰性表達(dá)組HCC患者的總體生存時(shí)間顯著短于SIPA1陽(yáng)性表達(dá)組的患者(41.0±6.6個(gè)月vs.66.0±5.2個(gè)月，P=0.003)，SIPA1陰性表達(dá)組的無瘤生存時(shí)間亦顯著短于SIPA1陽(yáng)性表達(dá)組(35.0±6.1個(gè)月

6、vs.61.1±5.4個(gè)月，P=0.002)。多元Cox回歸模型顯示SIPA1陰性表達(dá)是HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 2.RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)SIPA1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3這3種侵襲轉(zhuǎn)移潛能依次升高的肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并以正常肝細(xì)胞系L02、常氏肝細(xì)胞系CCL13作為對(duì)照。結(jié)果顯示SIPA1mRNA和蛋白在HepG2、HCCLM3和MHCC97-L肝癌細(xì)

7、胞系中的表達(dá)水平顯著低于CCL13和L02正常肝細(xì)胞系(P<0.05)，且其表達(dá)水平在HepG2、MHCC97-L、HCCLM3細(xì)胞中依次降低(P<0.05)，提示SIPA1表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)確定以SIPA1表達(dá)水平最低的HCCLM3為過表達(dá)質(zhì)粒的靶細(xì)胞。
　　 3.我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SIPA1，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染并行G418篩選，經(jīng)RT-PCR和Wester

8、n blot等方法驗(yàn)證SIPA1的表達(dá)，最終獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HCCLM3SIPA1+和空質(zhì)粒對(duì)照組HCCLM3vector細(xì)胞。采用MTT法、粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell等實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)兩組細(xì)胞在細(xì)胞增殖與粘附能力、遷移運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力上的差別。MTT研究結(jié)果顯示，HCCLM3SIPA1+的細(xì)胞增殖能力較HCCLM3vector顯著下降(P<0.05)；粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與HCCLM3vector細(xì)胞相比，HCCLM

9、3SIPA1+細(xì)胞與FN的粘附能力明顯減弱(P<0.05)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示HCCLM3SIPA1+與HCCM3vector相比，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力均顯著下降(P<0.05)。以上體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)上調(diào)SIPA1的表達(dá)可顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HCCLM3SIPA1+細(xì)胞和HCCLM3vector細(xì)胞的骨架蛋白F-actin的形成情況，發(fā)現(xiàn)SIPA

10、1能明顯減少F-actin的形成。
　　 4.為進(jìn)一步體內(nèi)觀察上調(diào)SIPA1對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，我們建立了裸鼠原位肝癌肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示，HCCLM3SIPA1+細(xì)胞在肝臟中成瘤體積明顯較HCCLM3vector細(xì)胞小，分別為1.57±0.08cm3和6.28±0.13cm3，(P<0.05)。通過裸鼠肺組織連續(xù)切片觀察肺轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)與HCCLM3vector組相比，HCCLM3SIA1組的肺轉(zhuǎn)移率顯著下降(16.7

11、％vs.83.3％，P=0.021)。由此證明，上調(diào)SIPA1可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 5.綜合已有的研究，我們推測(cè)SIPA1可能通過Rap1-ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。為證實(shí)上述假說，我們首先檢測(cè)了HCCLM3SIPA1+細(xì)胞和HCCLM3Vector細(xì)胞中Rap1的活性，研究發(fā)現(xiàn)與后者相比，過表達(dá)SIPA1的HCCLM3SIPA1+細(xì)胞中，Rap1的活性顯著降低(P<0.05)；

12、免疫共沉淀技術(shù)亦證實(shí)HCCLM3SIPA1+細(xì)胞中SIPA1與Rap1存在直接的相互作用。進(jìn)而，我們采用Rap1激活因子8CPT-2Me-cAMP(終濃度100μM)，恢復(fù)HCCLM3SIPA1+細(xì)胞中Rap1的活性，反向驗(yàn)證Rap1在SIPA1調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)Rap1的活性后，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力和和侵襲能力得到顯著恢復(fù)(P<0.05)且細(xì)胞骨架蛋白F-actin表達(dá)亦得到明顯恢復(fù)。Western blot證實(shí)H

13、CCLM3SIPA1+細(xì)胞中Rap1下游基因ERK的磷酸化水平顯著下降(P<0.05)，恢復(fù)Rap1活性后p-ERK的表達(dá)得到恢復(fù)。上述研究結(jié)果證實(shí)，SIPA1可通過下調(diào)Rap1-ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)SIPA1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與肝癌分化差、多結(jié)節(jié)、靜脈侵犯等臨床病理特征密切相關(guān)，同時(shí)與肝細(xì)胞癌預(yù)后差和術(shù)后早期發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。SIPA1是肝細(xì)胞癌