腦缺血后海馬CA1區(qū)caspase非依賴性凋亡相關(guān)蛋白表達水平的改變以及亞細胞定位.pdf

1、腦血管病發(fā)病率高,嚴重危害人類健康。腦中風(fēng)是目前最常見的危及人類生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是當(dāng)今第二大死亡因為及首位致殘因為。腦缺血損傷所致的神經(jīng)元大量死亡是導(dǎo)致中風(fēng)后神經(jīng)功能喪失的主要因為,而目前仍未闡明缺血性腦損傷的機制,臨床上也缺乏有效的治療手段。因此,研究缺血性神經(jīng)元死亡機制,探索新的治療靶點將具有重要意義。
　　 腦中風(fēng)可引起缺血中心區(qū)(缺血壞死區(qū))神經(jīng)元的急性損傷,以及缺血半暗區(qū)(缺血壞死區(qū)周圍有一較病灶中心密度稍低的區(qū)域

2、,稱病灶周圍區(qū)或半暗區(qū))神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷,即遲發(fā)件神經(jīng)元死亡。遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的發(fā)生機制主要為凋亡,凋亡是一種高度調(diào)節(jié)的程序件細胞死亡過程,以往的研究表明,caspase(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)依賴性機制在這一過程中起重要作用,但最近有越來越多的研究表明casepase非依賴性機制也參與了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。雖然目前對caspase非依賴性細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制尚不明確,但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與caspase非依賴性細胞凋亡相關(guān)的分子,如

3、Bcl-2與腺病毒E1B-19K相互作用蛋白3(BNIP3),凋亡誘導(dǎo)因了(AIF),核酸內(nèi)切酶G(EndoG)等。我們實驗室的前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型中,BNIP3的表達升高并且插入到線粒體上,繼而誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的AIF由線粒體釋放,轉(zhuǎn)位到細胞核引起細胞損傷。但BNIP3是否參與大鼠傘腦缺血/再灌注損傷中海馬神經(jīng)元的死亡以及是否發(fā)生AIF的核轉(zhuǎn)位目前還不清楚。
　　 BNIP3

4、是一種促凋亡蛋白,屬于Bcl-2家族促細胞凋亡亞家族中的BH3-only亞家族,研究表明BNIP3參與了包括上皮細胞,心肌細胞,神經(jīng)膠質(zhì)細胞,神經(jīng)元等多種細胞的死亡過程。Bcl-2家族眾多成員參與了細胞損傷過程。其中BNIP3是BH3-Only亞家族中對缺氧最敏感的促凋亡蛋白。Bcl-2家族大多數(shù)促凋亡成員均含有為其線粒體定位及誘導(dǎo)細胞死亡所需的BH3結(jié)構(gòu)域和C末端跨膜結(jié)構(gòu)域。BNIP3也含有BH3結(jié)構(gòu)域,但該結(jié)構(gòu)域既不是BNIP3與其

5、他Bcl-2家族成員形成異二聚體所必須的,也不是BNIP3誘導(dǎo)細胞死亡所必需的,這表明BNIP3不同于其他Bcl-2家族蛋白。研究進一步表明,內(nèi)源性BNIP3與線粒體疏松結(jié)合,當(dāng)受到凋亡信號刺激時,BNIP3靠它的跨膜結(jié)構(gòu)域插入線粒體外膜,引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pores,PTP)開放,線粒體膜內(nèi)外電化學(xué)梯度降低,氧自由基產(chǎn)生增多,線粒體功能失調(diào),進而導(dǎo)致細胞死亡。BNIP3介導(dǎo)的細胞死

6、亡不依賴于細胞色素C的釋放以及Apaf-1,caspase的激活,以早期質(zhì)膜以及線粒體膜損傷為特點。但BNIP3是否參與大鼠傘腦缺血/再灌注損傷中海馬神經(jīng)元的死亡以及引起細胞死亡的機制目前還不清楚。
　　 目前對于:BNIP3引起細胞死亡的下游分子機制還未明確。AIF是已知的線粒體功能障礙的下游分子之一,參與了caspase非依賴性細胞死亡通路。AIF是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的凋亡相關(guān)蛋白。當(dāng)細胞受到特定的凋亡誘導(dǎo)信號的刺激后,

7、線粒體膜上的PTP打開,允許它們從線粒體釋放到胞漿,并轉(zhuǎn)位到核內(nèi)進而引起DNA的大片段裂解,但AIF本身沒有核酶的特性,它的DNA降解作用是通過其它核酶來實現(xiàn)的。EndoG很可能是AIF的相互作用分子。AIF和EndoG參與多種細胞的死亡通路,但其是否是BNIP3誘導(dǎo)細胞死亡的下游分了目前尚不明確。
　　 本研究觀察了腦缺血/再灌注后大鼠海馬神經(jīng)元的死亡情況。采用改良的Pulsinelli四血管閉塞法制做大鼠全腦缺血再灌注模型,

8、通過尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元的存活狀況,與假手術(shù)組相比,缺血后7天的海馬CA1區(qū)有大量神經(jīng)細胞皺縮,胞核碎裂消失,結(jié)構(gòu)不清,證明我們的模型確實引起海馬神經(jīng)元的死亡。
　　 首先,通過Western Blot觀察了BNIP3在腦缺血/再灌住后不同時間點海馬CA1區(qū)全細胞以及線粒體中的表達清況。在缺血/再灌注后不同時間點,假手術(shù)組于術(shù)后24小時麻醉大鼠,斷頭取腦,分離海馬CA1區(qū),提取全細胞及線粒體蛋白樣品。全細胞樣品的結(jié)果顯示BNI

9、P3單體(20KD)于缺血/再灌注后增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.117,P=0.000)；缺血/再灌注后6,12,24,48小時組BNIP3單體(20KD)蛋白的表達水平分別是假手術(shù)組的1.51±0.10,1.804±0.14,2.14±0.11,2.46±0.23倍,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BNIP3雙聚體(60KD)在缺血/再灌注后表達水平上調(diào),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.113,P=0.000)。缺血/再灌注后6,

10、12小時組BNIP3雙聚體(60KD)蛋白的表達水平分別是假手術(shù)組的1.82±0.13,1.86±0.10倍,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),缺血/再灌注后1,24,48小時組與假手術(shù)組比較雖然沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但仍有增高的趨勢。在海馬CA1區(qū)線粒體中沒有觀察到BNIP3單體的表達,而BNIP3雙聚體在缺血/再灌注后表達水平增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.214,P=0.000)。缺血/再灌注后12,24小時組BNIP3雙聚體表達水平

11、分別是假手術(shù)組的1.74±0.13,1.54±0.04倍,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BNIP3表達水平的改變提示它可能參與了大鼠腦缺血/再灌注后海馬神經(jīng)元的死亡。
　　 其次,通過Western.Blot觀察AIF在腦缺血/再灌灃后不同時間點的大鼠海馬CA1區(qū)全細胞的表達清況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注損傷后AIF表達水平上調(diào),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.643,P=0.49)。缺血/再灌注后12,24,48小時組AIF表達水平

12、分別是假手術(shù)組的1.77±0.24,1.67±0.20,2.00±0.37倍,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AIF表達水平的改變提示它可能參與了大鼠腦缺血/再灌灃后海馬神經(jīng)元的死亡。
　　 最后,為明確.AIF是否發(fā)生了從線粒體到細胞核的轉(zhuǎn)位,我們又進一步研究了海馬CA1區(qū)線粒體中AIF表達水平的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后AIF表達水平下調(diào)(F=18.612,P=0.000),表明AIF可能發(fā)生了從線粒體的釋放,并且從時間

13、上觀察AIF由線粒體釋放較晚于線粒體BNIP3的上調(diào),提示AIF可能參與了BNIP3介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元死亡通路。另一方面,通過Western Blot觀察AIF在腦缺血/再灌注后不同時間點的海馬CA1區(qū)細胞核內(nèi)的表達清況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)細胞核上AIF蛋白水平上調(diào),差別有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.447,P=0.016),提示AIF從線粒體轉(zhuǎn)位到細胞核。為明確AIF是否發(fā)生了從線粒體到細胞核的轉(zhuǎn)位,我們又研究了海馬CA1區(qū)細胞