腦缺血預(yù)處理對海馬CA1區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1a mRNA表達的影響.pdf

1、目的:近年來,隨著人口老齡化,腦缺血性疾病的發(fā)病呈上升趨勢,其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率不僅嚴(yán)重危害患者的健康和生活質(zhì)量,同時在腦缺血性疾病中,神經(jīng)元對缺血性損害極為敏感,經(jīng)過一定時間的缺血后,神經(jīng)元會大量死亡,此時即使恢復(fù)血液供應(yīng),神經(jīng)元亦難以再生,仍然會給患者留下嚴(yán)重的后遺癥。因此,如何提高神經(jīng)元對缺血性損傷的抵抗力和耐受力,使其在蒙受較嚴(yán)重的缺血打擊時減輕損傷、保持存活,以保證恢復(fù)血液供應(yīng)后這些神經(jīng)元仍能具有正常功能,對腦缺血性

2、疾病的治療具有很重要的現(xiàn)實意義。
　　 大量動物實驗發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重腦缺血后,海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元大量死亡。若預(yù)先給予實驗動物輕微,不至于引起神經(jīng)元損傷的腦缺血,則可以保護神經(jīng)元,使其能夠耐受其后的通常會引起神經(jīng)元損傷的較嚴(yán)重的腦缺血。這一現(xiàn)象被稱為腦缺血耐受;預(yù)先給予的輕微、短時的腦缺血稱為腦缺血預(yù)處理。研究腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的產(chǎn)生機制,并據(jù)此探索、開發(fā)提高神經(jīng)元對缺血性損害的耐受能力的方法,可以為臨床上腦缺血性疾病的治療提

3、供新思路。
　　 早在1984年,谷氨酸(glutamic acid,Glu)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)就已經(jīng)被廣泛接受。目前認為Glu是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實,腦缺血時細胞外液谷氨酸等興奮性氨基酸的濃度異常升高。這些興奮性氨基酸與突觸后膜或突觸前膜的離子型或代謝型谷氨酸受體結(jié)合后,可產(chǎn)生神經(jīng)毒效應(yīng)。降低腦缺血時細胞外液中谷氨酸濃度,是防治其興奮性毒性作用、減輕缺血性神經(jīng)元損傷的重要手段。由

4、于細胞外沒有谷氨酸代謝酶,中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外的谷氨酸的代謝主要依靠興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(excitatory amino acid transports,EAATs)來維持。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體可以轉(zhuǎn)運細胞外的谷氨酸進入細胞內(nèi),并降低谷氨酸在突觸間隙的濃度。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體在及時終止突觸傳遞以及防止谷氨酸受體過度興奮中均發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)5種EAATs,分別是EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)、EAAT3(EAAC1

5、)、EAAT4和EAAT5。一般認為,星型膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取能力遠大于神經(jīng)元,而GLAST和GLT-1為膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)運體,主要分布在星型膠質(zhì)細胞。
　　 既往實驗已經(jīng)證明腦缺血預(yù)處理(cerebralischemic preconditioning,CIP)可使星型膠質(zhì)細胞突起延長,環(huán)繞錐體神經(jīng)元,同時表達大量的GLT-1,并使其對谷氨酸的攝取增強;損傷性腦缺血可致海馬CA1區(qū)GLT-1表達下調(diào),尤其死亡的錐體細胞周圍下調(diào)更為

6、明顯,甚至表現(xiàn)為大片的GLT-1表達缺失;應(yīng)用GLT-1抑制劑(dihydrokainate,DHK)、或應(yīng)用GLT-1的反義寡核苷酸減少GLT-1的表達,均可抑制腦缺血預(yù)處理的腦保護作用。這些研究結(jié)果表明GLT-1確實參與腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 最近有研究報道,GLT-1存在剪接變異體。根據(jù)其羧基端不同,GLT-1存在四種剪接變異體,其中3種為C末端剪接變異體,分別被命名為GLT-1a(GLT-1a)、GLT-

7、1b(GLT-1v)以及GLT-1c(Rauen et al2004)。1種為N末端剪接變異體(rGLT-1A)(Rozyczka and Engele2005)。其中,GLT-1c在大鼠腦組織中表達量很低,GLT-1a和GLT-1b在大鼠的腦組織中表達豐富。GLT-1a在海馬當(dāng)中的表達占總GLT-1的90％左右。既往研究發(fā)現(xiàn),在實驗動物腦缺血缺氧的情況下GLT-1的剪接變異體的表達可發(fā)生變化,但究竟是何種類型的剪接變異體在腦缺血耐受誘

8、導(dǎo)過程中發(fā)揮作用,目前尚未見到任何相關(guān)報道。鑒于GLT-1a和GLT-1b在大鼠的腦組織中表達豐富,本課題擬主要觀察GLT-1a在腦缺血耐受誘導(dǎo)中的作用。
　　 方法:
　　 健康雄性Wistar大鼠(260～300g)96只,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。在實驗室飼養(yǎng)1～2d以適應(yīng)環(huán)境,然后用于實驗。除了control組外,將凝閉雙側(cè)椎動脈的Wistar大鼠隨機分組。具體如下:(1)Sham組(n=24):只暴露雙側(cè)

9、頸總動脈,不阻斷血流;(2)腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic prcconditioning,CIP)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動脈3min后恢復(fù)血流灌注;(3)腦缺血打擊(ischemic insult,Ⅱ)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復(fù)血流灌注;(4)腦缺血預(yù)處理+腦缺血打擊(CIP+Ⅱ)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動脈3min作腦缺血預(yù)處理,后恢復(fù)血流灌注。再灌注2d后,夾閉雙側(cè)頸總動脈8min作

10、為腦缺血打擊,后再恢復(fù)血流灌注;除了control組外,其他各組分別于末次手術(shù)后0min、1h、3h、6h、1d、3d、5d、7d時取海馬CA1區(qū)(每個時間點n=3),后應(yīng)用RT-PCR法研究GLT-1a mRNA的表達數(shù)量。
　　 結(jié)果:
　　 Control組大鼠海馬GLT-1a mRNA有一定表達。
　　 0min、1h時間點比較:sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與Ⅱ組及s

11、ham組相比無顯著差異(p＞0.05)。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比明顯升高(p＜0.05)。
　　 3h、6h時間點比較:sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與sham組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組相比稍有降低,無顯著差異(p＞0.05)。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比明顯升高(p＜0.05)。
　　 1d時間點:sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與sh

12、am組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組、CIP組及CIP+Ⅱ組相比均明顯降低(p＜0.05)。
　　 3d時間點:sham組與Control組相比稍有升高,無顯著差異(p＞0.05)。CIP組與sham組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組、CIP組及CIP+Ⅱ組相比均明顯降低(p＜0.05)。
　　 5d、7d時間點比較:sham組與Control組相比無顯著差異(p＞0.05)。CIP組與sh