選擇性環(huán)氧化酶2下游通路mPGES1-PGE2-EP2在慢性腎衰竭甲狀旁腺異常增生中的作用研究.pdf

1、第一部分慢性腎衰竭時(shí)COX2下游通路mPGES1-EP2在增生的甲狀旁腺組織中的異常表達(dá)
　　目的：
　　多種癌前病變及腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)COX2與mPGES1的協(xié)同高表達(dá)，該通路代謝產(chǎn)生的PGE2的受體EP2表達(dá)增加，而且表達(dá)陽(yáng)性率越高，腫瘤惡性程度越高。慢性腎衰竭時(shí)在低鈣、高磷或活性VitD缺乏等因素的持續(xù)刺激下，甲狀旁腺由正常的低分化狀態(tài)向增生狀態(tài)轉(zhuǎn)變，并逐漸呈自主性增殖，最終可導(dǎo)致單克隆結(jié)節(jié)、腺瘤甚至腺癌。本課題組既往

2、研究發(fā)現(xiàn)在慢性腎衰竭患者及大鼠模型增生的甲狀旁腺結(jié)節(jié)中均存在COX2的高表達(dá)，并且表達(dá)量與增生程度相關(guān)。為了證實(shí)COX2下游通路mPGES1-EP2在慢性腎衰竭甲狀旁腺異常增生的作用，我們?cè)诒静糠值难芯恐袛M通過(guò)體內(nèi)研究直接觀察mPGES1-EP2是否參與慢性腎衰竭繼發(fā)性甲旁亢的發(fā)生發(fā)展。
　　(一)慢性腎衰竭繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者甲狀旁腺組織中COX2下游通路mPGES1-EP2的表達(dá)
　　方法：
　　2009年4

3、月至2010年3月在我院行甲狀旁腺全切加自體前臂移植術(shù)的9名尿毒癥患者的術(shù)后大、小結(jié)節(jié)共37個(gè)。制備石蠟和冰凍切片，HE染色區(qū)分甲狀旁腺結(jié)節(jié)性與彌漫性增生，分別用免疫組化、免疫熒光和Westernblot檢測(cè)PGE2合成酶mPGES1，PGE2受體EP2以及增殖指標(biāo)PCNA在甲狀旁腺組織中的分布區(qū)域和表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.HE染色顯示37個(gè)結(jié)節(jié)中有16個(gè)結(jié)節(jié)為輕度彌漫性增生，21個(gè)結(jié)節(jié)為結(jié)節(jié)性增生。
　　2.免

4、疫組化顯示彌漫性增生的甲狀旁腺組織中mPGES1表達(dá)較少，結(jié)節(jié)性增生的甲狀旁腺mPGES1表達(dá)明顯增加，其陽(yáng)性染色主要分布于甲狀旁腺細(xì)胞漿。采用免疫熒光的方法進(jìn)一步證實(shí)mPGES1主要表達(dá)在甲狀旁腺細(xì)胞的胞漿，尤其是細(xì)胞核的周?chē)?br>　　3.免疫組化顯示彌漫性增生的甲狀旁腺組織中幾乎未見(jiàn)EP2的表達(dá)，而結(jié)節(jié)性增生的甲狀旁腺組織中EP2表達(dá)明顯增加，散在性分布于細(xì)胞胞漿。免疫熒光的方法同樣證實(shí)EP2主要表達(dá)在細(xì)胞的胞漿，尤其是細(xì)胞核的

5、周?chē)?br>　　4.Westernblot檢測(cè)證實(shí)EP2的蛋白表達(dá)水平在結(jié)節(jié)性增生部位明顯高于彌漫性增生部位，增殖指標(biāo)PCNA的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　慢性腎衰竭繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者增生的甲狀旁腺組織中存在mPGES1-EP2的異常高表達(dá)，在結(jié)節(jié)性增生的部位更明顯，可能與甲狀旁腺的增生有關(guān)。
　　(二)尿毒癥繼發(fā)性甲旁亢大鼠增生的甲狀旁腺組織中COX2下游通路mPGES1-PGE2-EP

6、2的表達(dá)
　　方法：
　　50只雄性SD大鼠，30只行5/6腎大部切除，20只行假手術(shù)。術(shù)后分2組：①假手術(shù)組(Sham)：假手術(shù)+正常飲食(P0.8％，Ca1.2％)；②腎大切組(Nx-HP)：5/6腎大部切除+高磷飲食(P1.2％，Ca1.2％)。3月后檢測(cè)各組大鼠腎功能、血鈣、血磷、iPTH水平；分離甲狀旁腺，石蠟包埋連續(xù)切片進(jìn)行HE染色，計(jì)算甲狀旁腺最大面積反映腺體大小；Elisa方法檢測(cè)PGE2水平；通過(guò)免疫組織化

7、學(xué)，WesternBlot方法或Real-timePCR方法檢測(cè)組織中mPGES1、EP2、PCNA的表達(dá)，采用Real-timePCR方法檢測(cè)EP1、EP3、EP4、IP、TPmRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.成模后12周，5/6腎大部切除大鼠出現(xiàn)明顯蛋白尿和腎功能?chē)?yán)重?fù)p害。與Sham組大鼠相比，Nx-HP組大鼠iPTH水平顯著升高，甲狀旁腺腺體明顯增大；PCNA陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，彌漫性分布于整個(gè)腺體；定量分析顯示甲狀

8、旁腺組織中PCNA蛋白和mRNA水平明顯升高；提示模型動(dòng)物出現(xiàn)慢性腎衰竭繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)及腺體彌漫性增生。
　　2.甲狀旁腺局部的PGE2水平增加，免疫組織化學(xué)染色顯示mPGES1，EP2在Sham組大鼠甲狀旁腺組織中幾乎未見(jiàn)表達(dá)，而Nx-HP組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，彌漫性分布于腺體主細(xì)胞胞漿。WesternBolt和Real-timePCR進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。應(yīng)用Real-timePCR檢測(cè)PGE2其他的受體表達(dá)，結(jié)果顯示

9、，Sham組與Nx-HP組兩組大鼠甲狀旁腺EP1、EP3、EP4mRNA的表達(dá)均無(wú)差異；兩組大鼠前列環(huán)素受體IPmRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；Nx-HP組大鼠TXA2受體TPmRNA較Sham組大鼠低下。
　　結(jié)論：
　　與正常對(duì)照組相比，5/6腎大部切除大鼠高磷飲食三個(gè)月后，出現(xiàn)明顯腎功能損害和繼發(fā)性甲旁亢伴甲狀旁腺增生；在增生的腺體中COX2下游通路mPGES1和EP2的表達(dá)顯著增加，與增生指標(biāo)PCNA密切相關(guān)，提示mPGES

10、1-EP2可能參與了尿毒癥時(shí)甲狀旁腺增生。
　　第二部分體外研究觀察COX2下游通路mPGES1-PGE2-EP2對(duì)甲狀旁腺異常增生的影響
　　目的：
　　本課題第一部分在體研究顯示COX2下游通路mPGES1-EP2在慢性腎衰竭異常增生的甲狀旁腺組織中表達(dá)增加，并與增殖指標(biāo)相關(guān)。為了排除眾多體內(nèi)因素的干擾，本部分研究將選擇甲狀旁腺全切加自體前臂移植術(shù)中所得的尿毒癥患者甲狀旁腺組織塊進(jìn)行體外孵育，旨在探討阻斷或促進(jìn)CO

11、X2下游通路mPGES1-PGE2-EP2的作用能否直接影響PTH分泌和甲狀旁腺的增生，從而揭示COX2下游通路mPGES1-PGE2-EP2在尿毒癥時(shí)甲狀旁腺異常增生中的確切作用。
　　方法：
　　體外37℃孵育新鮮獲得的尿毒癥患者甲狀旁腺組織塊，首先觀察阻斷mPGES1-PGE2-EP2對(duì)高磷刺激的影響，分組如下：(1)正常磷組(NP)：DMEM-F12培養(yǎng)液；(2)高磷組(HP)：高磷培養(yǎng)液(4mmol/L)；(3)H

12、P+NS398(1μmol/L)：NS398為COX2抑制劑；(4)HP+MK886(1μmol/L)：MK886為mPGES1抑制劑；(5)HP+AH6809(1μmol/L)：AH6809為EP2阻斷劑。然后觀察不同濃度EP2受體激動(dòng)劑Butaprost的作用，分組如下：(1)對(duì)照組：DMEM-F12培養(yǎng)液；(2)10-7MButaprost：(3)10-5MButaprost；(4)10-5MButaprost。最后觀察不同濃度P

13、GE2的直接作用，分組如下：(1)對(duì)照組：DMEM-F12培養(yǎng)液；(2)10-7MPGE2；(3)10-6MPGE2；(4)10-5MPGE2。24小時(shí)后收集上清液和各組細(xì)胞，抽提總蛋白，總RNA。用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)iPTH水平，用Real-timePCR檢測(cè)PreproPTH基因水平，Westernblot和Real-timePCR檢測(cè)PCNA蛋白和基因水平。
　　結(jié)果：
　　1.在體外孵育的尿毒癥患者甲狀旁腺組織塊中，

14、高磷刺激可導(dǎo)致上清液中iPTH水平明顯升高(改變的倍數(shù)：NP1.00±0.49，HP4.54±2.11，p<0.05)，分別給予COX2拮抗劑NS398(10-6M)、mPGES1拮抗劑MK886(10-6M)或EP2拮抗劑AH6089(10-6M)干預(yù)后，高磷的上述作用被明顯抑制(改變的倍數(shù)：NS398+HP2.00±1.24，MK886+HP1.88±0.58，AH6809+HP0.80±0.76，p<0.05)。定量檢測(cè)prepr

15、oPTHmRNA的表達(dá)水平也呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)。另外，高磷刺激后甲狀旁腺組織中PCNA的蛋白和基因表達(dá)水平也明顯增加，給予各種拮抗劑干預(yù)后，高磷的上述作用被明顯抑制，提示COX2-mPGES1-PGE2-EP2通路參與了高磷誘導(dǎo)的iPTH分泌和甲狀旁腺增生。
　　2.在體外孵育的甲狀旁腺組織塊中給予Butaprost濃度為10-7M時(shí)，上清液中PTH水平無(wú)明顯變化；當(dāng)濃度上升為10-6M時(shí)，PTH水平顯著升高(1.74±0.28，

16、p<0.05)；但Butaprost濃度為10-5M時(shí)，PTH水平反而下降(10-5M0.42±0.18，p>0.)。preproPTHmRNA水平以及PCNA蛋白和基因的表達(dá)也有相似的變化趨勢(shì)，提示EP2激動(dòng)劑能直接促進(jìn)iPTH合成分泌和甲狀旁腺增生。
　　3.直接給予體外孵育的甲狀旁腺組織塊PGE2刺激，當(dāng)濃度為10-7M和10-6M時(shí)，上清液中PTH水平均無(wú)明顯變化；當(dāng)PGE2濃度上升為10-5M時(shí)，PTH水平顯著升高(3.

17、88±1.66，p<0.05)。組織塊中preproPTHmRNA水平的升高在PGE2濃度為10-6M時(shí)已出現(xiàn)，當(dāng)PGE2上升為10-5M時(shí)更明顯(Control14.78±3.59vs。10-5M271.26±150.49，p<0.05)。當(dāng)PGE2濃度為10-7M時(shí)，組織塊中PCNA蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但隨著PGE2濃度上升，PCNA表達(dá)水平顯著增加(Control0.29±0.12vs.10-6M1.72±0.40，10-6M2.