mPGES1下游通路PGE2-EP2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的:
　　本課題主要研究mPGES1下游通路前列腺素E2（PGE2）及其受體(E-prostanoid receptors)EP1-EP4與肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，明確PGE2在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能激活某種EP受體亞型從而促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展，為阻斷mPGES1下游通路PGE2-EP2而治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（E

2、LISA）的實(shí)驗(yàn)方法檢測30例肝癌及其相應(yīng)的癌旁組織與6例正常肝組織中PGE2的含量，并統(tǒng)計(jì)分析在肝癌組織中PGE2含量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)的方法在mRNA水平上檢測34例肝癌組織中EP1-EP4受體表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)EP受體表達(dá)量與肝癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，分析4種EP受體與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　3.采用免疫組化的方法檢測組織芯片中145例肝癌

3、患者肝癌及癌旁組織中EP1-EP4四種受體的表達(dá)情況，觀察EP受體在肝癌組織中的定位。
　　4.應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western Blot）的方法在蛋白水平上比較34例肝癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中EP1-EP4受體的表達(dá)情況的不同。
　　5.培養(yǎng)肝癌細(xì)胞(HepG2,Hep3B,Huh7,MHCC-97h,SMMC-7721等），檢測肝癌細(xì)胞中PGE2的含量及其4種EP受體表達(dá)情況。
　　6.采用MTT、Transwe

4、ll、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，檢測添加外源性PGE2和添加EP2受體抑制劑作用后，肝癌細(xì)胞株增殖、侵襲遷移能力的改變情況。
　　7.應(yīng)用Western Blot和RT-PCR的方法分組檢測應(yīng)用EP2受體抑制劑及添加外源性PGE2后，肝癌細(xì)胞中EP2受體的表達(dá)的不同，探討在肝癌細(xì)胞中PGE2通過調(diào)控EP2受體發(fā)揮何種作用。
　　結(jié)果：
　?。?）ELISA實(shí)驗(yàn)檢測30例HCC患者肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織和6例正常肝組織，結(jié)果

5、表明在肝癌組織中PGE2含量(605.78±16.41)pg高于癌旁組織(456.75.±13.37)pg和正常肝組織（124.35±5.79） pg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）結(jié)合ELISA結(jié)果，經(jīng)卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，PGE2含量與HCC患者的生存時(shí)間、肝細(xì)胞癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度、有無硬化背景有關(guān)，P<0.05，而與其他臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（3）RT-PCR結(jié)果

6、顯示，在34例HCC患者肝癌組織中，與相應(yīng)癌旁肝組織的表達(dá)量相比，4個(gè)EP受體在mRNA水平的相對表達(dá)量（Relative quantity,RQ）分別為：(0.54±2.44)；(0.77±1.13)；(2.21±3.74)；(1.37±2.70)，4個(gè)受體在癌組織與相應(yīng)癌旁組織中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，在肝癌及癌旁組織中，EP1-EP4四種受體的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　?。?/p>

7、5）Western Blot結(jié)果顯示：在34例HCC患者中，EP2蛋白的相對表達(dá)量（1.586±0.108）高于相應(yīng)癌旁組織（0.765±0.089），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　?。?）Western Blot結(jié)果顯示：4個(gè)EP受體在蛋白水平的表達(dá)EP2最高(相對表達(dá)量1.586±0.108），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　?。?）對RT-PCR、Western Blot及ELISA結(jié)果與臨床病理參

8、數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示在肝癌組織中PGE2含量與EP2受體表達(dá)量呈正相關(guān)，EP2受體在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)與患者的年齡，腫瘤分化程度，術(shù)后是否復(fù)發(fā)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與其他臨床病理參數(shù)無關(guān)。
　?。?）Western Blot結(jié)果顯示，6種肝癌細(xì)胞中4種EP受體均有表達(dá)，在HepG2細(xì)胞EP2受體蛋白高表達(dá)。
　　（9）Western Blot結(jié)果顯示，添加外源性PGE2作用后

9、，EP2受體表達(dá)與未添加外源性PGE2組相比明顯增加（P<0.05）。
　?。?0）ELISA結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)中添加EP2受體抑制劑后，PGE2含量增加，且MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2增殖減慢，提示PGE2可能通過EP2受體促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。
　?。?1）細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EP2受體抑制劑濃度越高（0μM,1μM,2μM,5μM），HepG2細(xì)胞侵襲的細(xì)胞數(shù)目越多（121.67±3.06，108

10、.33±8.50，92.67±3.05，69.67±3.05）個(gè)，遷移的細(xì)胞數(shù)目也越多（141.67±3.79，135.67±4.51，96.33±4.51，86.33±7.37）個(gè)，其侵襲遷移能力越強(qiáng)（P<0.05）；同時(shí)外源性PGE2組、EP2受體抑制劑組與對照組相比，外源性PGE2組HepG2細(xì)胞侵襲遷移的細(xì)胞數(shù)增加，而EP2抑制劑組HepG2細(xì)胞侵襲遷移的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.mPGE