Nm23-H-,1-基因逆轉(zhuǎn)肺癌轉(zhuǎn)移表型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文Nm23H基因逆轉(zhuǎn)肺癌轉(zhuǎn)移表型的實(shí)驗(yàn)研究姓名：車國(guó)衛(wèi)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（胸心血管外科）指導(dǎo)教師：周清華20030601日川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)博士專業(yè)學(xué)位論文導(dǎo)師周清華教授1應(yīng)用Southernblot、RTPCR、Westernblot、PCRSSCP技術(shù)從9株人肺癌細(xì)胞株中篩選鑒定出缺失nm23Hl基因的人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株L9981。該細(xì)胞株k—ras基因外顯子l第12、13和6l位點(diǎn)堿基無(wú)突變，且仍具有母系

2、細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移表型。2應(yīng)用質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化，酶切，連接技術(shù)成功構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體pLXSNnm23Hl—EGFP，經(jīng)DNA序列分析證明pLXSNnm23H1EGFP質(zhì)粒中nm23Hl基因的終止密碼發(fā)生突變，由ATG變?yōu)門(mén)GA，將質(zhì)粒pLXSNrim23H1EGFP轉(zhuǎn)染L9981細(xì)胞株后，nm23H1EGFP融合蛋白能夠在受染細(xì)胞內(nèi)持續(xù)，穩(wěn)定和高效表達(dá)。3應(yīng)用巢氏RTPCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981轉(zhuǎn)染nm23

3、。Hl基因前后“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”相關(guān)基因表達(dá)水平改變，觀察到：(1)L9981rim23Hl細(xì)胞株中13Catenin，ECadherin和TIMP1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L9981pLXSN和原代細(xì)胞株L9981po001)。(2)L9981一nm23Hl細(xì)胞株中MMP一2、CD44V6，ⅦGF和C—met基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于L998IpLXSN和L9981細(xì)胞株(pO001)。(3)L

4、9981一nm23Hl移植瘤組織ran23一Hl，B—catein，ECadherin和TIMP1基因蛋白表達(dá)水平均顯著高于L9981pLXSN和L9981細(xì)胞株p00∥，而L9981nm23Hl細(xì)胞株中MMP一2，VEGFCD44V6和C—Met基因蛋白表達(dá)水平均顯著低于L9981一pLXSN和L9981細(xì)胞株(pO000。4應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到：(1)L9981rim23H，細(xì)胞株的體外增殖能力，克隆形成率和體外侵襲力均顯著