nm23-H-,1-基因突變對人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控機(jī)制的影響.pdf

1、本研究的目的是，(1)探討nm23-H<.1>基因突變對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響；(2)探討nm23-H<,1>基因突變對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；(3)nm23-H<,l>基因突變對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中經(jīng)典wm信號通路中關(guān)鍵激酶GSK-3β活性的影響；(4)nm23-H<,1>基因突變對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株體外侵襲力的影響。 材料與方法：在前期研究工

2、作的基礎(chǔ)上，本研究以人低轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NL9980、人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981、空載體轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-pEGFP細(xì)胞株、野生型nm23-H<,l> cDNA基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細(xì)胞株、第44位點(diǎn)發(fā)生Ser→Ala點(diǎn)突變的nm23-H<,l>基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-nm23-H<,1><'44A>-pEGFP細(xì)胞株、第96位點(diǎn)發(fā)生Pr0→ser點(diǎn)突變的nm

3、23-H<,1>基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-nm23-H<,1><'P96S>-pEGFP細(xì)胞株、第118位點(diǎn)發(fā)生His→Phe點(diǎn)突變的nm23-H<,l>基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-rim23-H<,1><'Hll8F>-pEGFP細(xì)胞株，第120位點(diǎn)發(fā)生Ser→G1y點(diǎn)突變的nm23-H<,1>基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-nm23-H<,l><'Sl20G>-pEGFP細(xì)胞株和第96位點(diǎn)發(fā)生ProSer點(diǎn)突變聯(lián)合第

4、120位點(diǎn)Ser→Gly點(diǎn)突變的nm23-Hl基因轉(zhuǎn)染L9981后的L9981-nm23-H<,I><'P96S+S120G>-pEGFP等9個細(xì)胞株作為研究對象，應(yīng)用RT-PCR和熒光定量PCR檢測上述肺癌細(xì)胞株中nm23-H<,l>、GSK-3β、β-catenin，Axin和APC基因mRNA表達(dá)水平及其差異；應(yīng)用Western blot檢測了上述肺癌細(xì)胞株胞漿中m23-H<,1>、β-catenin、磷酸化β-catenin、G

5、SK-3β，Axin和APC蛋白表達(dá)水平及其差異，胞核中B-catenin，磷酸化β-catenin和GSK-3β蛋白表達(dá)水平及其差異；應(yīng)用免疫共沉淀同位素閃爍計數(shù)檢測了上述肺癌細(xì)胞株胞漿和胞核中GSK-3β活性及其差異；應(yīng)用Boyden小室法檢測了上述肺癌細(xì)胞株體外侵襲能力及其差異。 結(jié)果：本研究在國內(nèi)外首次觀察到： 1．上述9個肺癌細(xì)胞株中均存在nm23-H<,l>、β-catenin、GSK-3 β，APC和Axi

6、n基因mRNA的表達(dá)。 2．NL9980細(xì)胞株中nm23-H<,l>，β-catenin、GSK-3 β和APC基因mRNA表達(dá)水平均顯著高于L9981細(xì)胞株(P<0.01)，但NL9980和L9981細(xì)胞株間Axin基因mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。 3．L9981細(xì)胞株中β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達(dá)水平均顯著低于L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細(xì)胞株(P<0.05)；但L

7、9981細(xì)胞株與突變nm23-H<,1>基因轉(zhuǎn)染L9981后的5個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株間β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達(dá)水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。L9981細(xì)胞株Axin基因mRNA表達(dá)水平顯著高于L9981-nm23-H<,1><'P96S+S120G>-pEGFP(P<0.05)；但L9981細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染野生型和其它4個突變rim23-H<,1>基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株間Axin基因mRNA表達(dá)水平比較，無顯著性差

8、異(P>0.05)；L9981細(xì)胞株與L9981-nm23-H<,1><'Sl20G>-pECFP細(xì)胞株間APC基因表達(dá)水平比較無顯著性差異(P>0.05)：L9981細(xì)胞株APE基因mRNA表達(dá)水平均顯著高于轉(zhuǎn)染野生型和突變nm23-H<,l>基因的其它4個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株(P<0.05)。 4．L9981-nm23-H<,1>-pEGFP細(xì)胞株與L9981轉(zhuǎn)染了突變nm23-H<,1>基因的5個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株間nm23-H<,l>

9、基因mRNA表達(dá)水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。 5.突變nrn23-H<,1>基因轉(zhuǎn)染L9981后的5個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株間，以及任何兩個突變nm23-H<,1>轉(zhuǎn)染L9981后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3 β基因mRNA表達(dá)水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。但APC和Axin基因mRNA表達(dá)水平部分細(xì)胞株間有顯著性差異。 6．NL9980與L9981細(xì)胞株問胞漿中n

10、m23-H<,l>蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異(P<0.05)。但野生型nm23-H<,1> cDNA和突變nm23-H<,1>基因轉(zhuǎn)染L9981后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中均存在nm23-H<,1>蛋白表達(dá)，其表達(dá)水平比較均無顯著性差異(P>0.05)。 7．上述9個細(xì)胞株間胞漿中APC蛋白、Axin蛋白表達(dá)水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)。 8．NL9980和L9981細(xì)胞株除胞核中β-catenin表達(dá)水平無顯著性差

11、異(P>O.05)外，NL9980細(xì)胞株胞漿中β-catenin和GSK-3 β蛋白表達(dá)水平、胞核中磷酸化β-catenin和GSK-3 β蛋白表達(dá)水平均顯著高于L9981細(xì)胞株(P<0.05)；NL9980細(xì)胞株胞漿中磷酸化β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于L9981細(xì)胞株。 9．L9981-nm23-H<,1>-pEGFP胞漿中β-catenin和GSK-3 β蛋白表達(dá)水平均顯著高于L9981細(xì)胞株(P>0.05)，L99

12、81-nm23-H<,1>-pEGFP細(xì)胞株胞漿中磷酸化β-catenin蛋白表達(dá)水平則顯著低于L9981細(xì)胞株(P<0.01)；但L9981-nm23-H<,1>-pEGFP與L9981細(xì)胞株胞核中β-catenin比較無顯著性差異(P>0.05)；L998 1-nm23-H<,1>-pEGFP胞核中磷酸化β-catenin和GSK-3 β蛋白表達(dá)水平均顯著高于L9981細(xì)胞株(P

13、>基因轉(zhuǎn)染L9981后的5個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株胞漿中β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細(xì)胞株(P<0.05)；但突變nm23-H<,l>基因轉(zhuǎn)染L9981后的5個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株與L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細(xì)胞株間胞核中β-catenin蛋白表達(dá)水平比較則無顯著性差異異(P>0.05)。 11．L9981-nm23-H<,l><'s44A>-pEGFP細(xì)胞株與L9981-n

14、m23-H<,l>-pEGFP細(xì)胞株間胞漿GSK-3 β蛋白表達(dá)水平比較無顯著性差異(P>0.05)， 而L9981-nm23-H<,l><'s44A>-pEGFP細(xì)胞株胞核中GSK-3 β蛋白表達(dá)水平顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP(P轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株胞漿和胞核中GSK-3β蛋白表達(dá)水平均顯著低于L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細(xì)胞株(P<0.01)。

15、 12．NL9980細(xì)胞株胞漿和胞核中GSK-3β活性均顯著高于L9981和5個突變nm23-H<,l>轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株(P<0.01)；但NL9980細(xì)胞株與L9981-nm23-H<,l>-pEGFP細(xì)胞株間胞漿和胞核中GSK-3β活性比較均無顯著性差異(P>0.05)。 13.NL9980細(xì)胞株體外侵襲力顯著低于L9981細(xì)胞株(P<0.01)；但NL9980與L9981-nm23-H<,1>-pEGFP和IL9981-nm

16、23-H<,1><'H118F>-pEGFP細(xì)胞株間體外侵襲力比較均無顯著差異(P>0.05)；但NL9980細(xì)胞株體外侵襲力顯著低于其余4個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株(P<0.05)。 結(jié)論：(1)不同轉(zhuǎn)移潛能人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3β基因mRNA表達(dá)水平均有顯著性差異；(2)具有不同nm23-H<,1>功能和轉(zhuǎn)移潛能的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株間nm23-H<,1>，β-catenin和GSK-3

17、β蛋白表達(dá)水平均有顯著性差異；(3)具有不同nm23-H<,1>功能和轉(zhuǎn)移潛能的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株間GSK-3β活性均有顯著性差異；(4)具有不同nm23-H<,1>功能和轉(zhuǎn)移潛能的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株間其體外侵襲力有顯著性差異；(5)nm23-H<,1>基因第44位Ser→Ala和第118位His→Pho突變對人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981 Wnt信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生明顯影響，并明顯增加L998l細(xì)胞株的體外侵襲能