轉(zhuǎn)移抑制因子nm23-H1與肺癌MAPK通路支架激酶KSR的相互作用關(guān)系研究.pdf

1、背景與目的 肺癌既是全世界發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，也是臨床治療療效最差的惡性腫瘤。肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌病人治療失敗和死亡的首要原因。已有的研究表明，肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)受多基因調(diào)控的極其復(fù)雜的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，一些基因起正向調(diào)控作用，而另一些則起負(fù)向調(diào)控作用。許多研究已經(jīng)證明，轉(zhuǎn)移抑制因子nm23-H1在肺癌中的低表達(dá)水平與肺癌的高轉(zhuǎn)移性和較差的臨床預(yù)后有關(guān)(如生存率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)，而MAPK

2、通路可能是nm23-H1調(diào)控的“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級(jí)聯(lián)”的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路。Ras激酶抑制劑(KSR)是在1995年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的基因，其功能主要是作為一個(gè)支架蛋白組裝MAPK及其上游調(diào)控子形成多蛋白復(fù)合體，從而加速M(fèi)APK通路的信號(hào)傳導(dǎo)。已有的研究結(jié)果表明，nm23-H1具有組氨酸激酶活性，而KSR的磷酸化狀態(tài)與KSR在MAPK信號(hào)通路中的作用有關(guān)。迄今，有關(guān)nm23-H1作為組氨酸激酶是否可通過(guò)改變KSR的磷酸化狀態(tài)來(lái)影響MAPK通路的信

3、號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制肺癌轉(zhuǎn)移的研究，國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道。因此本研究的目的就是探討nm23-H1與KSR之間是否存在相互作用關(guān)系，nm23-H1基因調(diào)控KSR的分子靶點(diǎn)，以及nm23-H1基因點(diǎn)突變對(duì)KSR基因的功能有何影響，為最終闡明nm23-H1調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建野生型和突變型pET28a-nm23-H1原核表達(dá)載體，pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N

4、-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達(dá)載體，并分別表達(dá)原核和真核蛋白，通過(guò)反相高效液相色譜技術(shù)(rHPLC)和放射自顯影的方法研究原核表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性；同時(shí)以轉(zhuǎn)染了野生型和突變型pEGFP-nm23-H1的L9981細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染了pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR的293T細(xì)胞株為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測(cè)nm23-H1與KSR是否具有相互作用關(guān)系；應(yīng)用

5、體外激酶活性實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)原核表達(dá)的野生型和突變型nm23-H1蛋白與真核表達(dá)的KSR，N-KSR和C-KSR之間是否存在磷酸化的關(guān)系， 結(jié)果 本研究在國(guó)內(nèi)外首次觀察到：(1)本研究成功構(gòu)建了pET28a-nm23-H1<'wT>、pET28a-nm23-H1<'P96S>、pET28a-nm23-H1<'Hl8F>、DET28a-nm23-H1<'S120G>，pET28a-nm23-H1<'s44A>和pET28a-nm23

6、-H1<'P96s-S120G>原核表達(dá)載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株后，蛋白表達(dá)量高，目的蛋白占細(xì)菌總蛋白量平均為45.98％，蛋白表達(dá)除pET28a-nm23-H1<'P96S-S120G>以包涵體形式表達(dá)外，其余均以可溶性表達(dá)為主；表達(dá)的目的蛋白能夠通過(guò)Westernblot鑒定。(2)野生型和突變型nm23-H1蛋白具有不同的NDPK活性，活性由大到小依次為nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S120G>、nm23

7、-H1<'P96S>、nm23-H1<'S44A>，nm23-H1<'Hll8F>和nm23-H1<'P965-S120G>。其中nm23-H1<'P96S>與mm23-H1<'s44A>間，以及nm23-H1<'Hll8F>與nm23-H1<'P96S-S120G>間NDPK活性比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而其余任何組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。(3)野生型和突變型nm23-H1蛋白具有不同的自身磷酸化活性，自身絲

8、氨酸和組氨酸磷酸化活性由大到小依次為nm23-H1<'P96S>、nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S44A>，nm23-H1和nm23-H1<'Hll8F>。其中nm23-H1<'WT>與nm23-H1<'S44A>間絲氨酸磷酸化活性比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而其余各組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。線性相關(guān)性分析結(jié)果顯示：野生型和突變型nm23-H1原核表達(dá)蛋白自身絲氨酸與組氨酸磷酸化活性間

9、呈非常顯著性正相關(guān)(r=0.985，P<0.01)。(4)本研究從pCMV-Tag2b-KSR載體上成功構(gòu)建出pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達(dá)載體；并成功地將上述三種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得Flag-KSR，F(xiàn)lag-N-KSR和Flag-C-KSR融合蛋白，目的蛋白可以通過(guò)Western blot鑒定。(5)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論在轉(zhuǎn)染了pEGFP-nm23-H1的L9981細(xì)胞、還

10、是轉(zhuǎn)染了DCMV-Tag2b-KSR的293T細(xì)胞，nm23-H1的免疫沉淀物中均能檢測(cè)到人或鼠KSR的存在。其中在L9981細(xì)胞，各組KSR的表達(dá)量接近一致，經(jīng)F檢驗(yàn)不具有顯著性差異(P>0.05)；在293T細(xì)胞，各組KSR的表達(dá)量從大到小依次為Flag-N-KSR，F(xiàn)lag-KSR和Flag-C-KSR，各組間KSR表達(dá)水平比較具有非常顯著性差異(P<0.01)；兩兩比較：任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。該研究結(jié)

11、果表明nm23-H1與KSR之間存在相互作用關(guān)系，這種相互作用關(guān)系主要發(fā)生于KSR的氨基端，與nm23-H1有無(wú)突變無(wú)明顯關(guān)系。(6)體外激酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag-KSR和Flag-N-KSR能被nm23-H1磷酸化，而Flag-C-KSR不能被磷酸化，磷酸化水平由高到低依次為Flag-N-KSR，F(xiàn)lag-KSR和Flag-C-KSR，經(jīng)F檢驗(yàn)具有非常顯著性差異(P<0.01)：兩兩比較：任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.0

12、1)，該結(jié)果說(shuō)明nm23-H1與KSR之間具有磷酸化關(guān)系，nm23-H1調(diào)控KSR的分子靶點(diǎn)位于KSR的氨基端：野生型和突變型nm23-H1蛋白磷酸化KSR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于不同蛋白具有不同的組氨酸激酶活性，因此KSR被磷酸化的強(qiáng)弱不等。其活性強(qiáng)度由大到小依次為nm23-H1<'WT>、nm23-H1<'S120G>、nm23一H1<'P96S>，nm23-H1<'S44A>和nm23-HI<'H118F>，經(jīng)F檢驗(yàn)具有非常顯著性差異

13、(P<0.01)。兩兩比較：nm23-H1<'WT>與nm23-H1<'S120G>間，nm23一H1<'P96S>，nm23-H1<'S44A>間組氨酸激酶活性比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而其余任何兩組間比較均有非常顯著性差異(P<0.01)。該結(jié)果說(shuō)明不同位點(diǎn)的nm23-H1基因點(diǎn)突變對(duì)nm23-H1蛋白磷酸化KSR的能力具有不同的影響。 結(jié)論 (1)成功構(gòu)建了pET28a-nm23-H1<,'WT>、pET28a

14、-nm123-Hl<'P96s>、pET28a-nm23-H1<'H118F>，pET28a-nm23-H1<'S120G>和pET28a-nm23-H1<'s44A>原核表達(dá)載體，并表達(dá)出具有活性的野生型和突變型nm23-H1蛋白：成功構(gòu)建了pCMV-Tag2b-KSR，pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表達(dá)載體，并獲得Flag-KSR，F(xiàn)lag-N-KSR和Flag-C-KSR融合蛋白；(2)不同

15、位點(diǎn)的nm23-H1基因點(diǎn)突變對(duì)rim23-H1蛋白NDPK和自身磷酸化活性具有不同的影響；(3)nm23-H1與KSR具有相互作用關(guān)系，這種相互作用關(guān)系主要發(fā)生于KSR的氨基端，與nm23-H1有無(wú)突變無(wú)明顯關(guān)系；(4)nm23-H1與KSR之間的關(guān)系主要為磷酸化關(guān)系，nm23-H1調(diào)控KSR的分子靶點(diǎn)位于KSR的氨基端，不同位點(diǎn)的nm23-H1基因點(diǎn)突變對(duì)nm23-H1蛋白磷酸化KSR的能力具有不同的影響，nm23-H1抑制肺癌轉(zhuǎn)移