TGF-β-,1-對(duì)Ⅱ型肺泡上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用與Snail、Erk1-2、STAT3的關(guān)系及IL-4、IFN-r的影響.pdf

1、一、TGF-B1對(duì)Ⅱ型肺泡上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制探討
　　 目的：探討轉(zhuǎn)化生長因子B1（TGF-B1）對(duì)Ⅱ型肺泡上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）的作用及其與胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（Erk1/2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）、Snail的關(guān)系。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一、體外培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（A549）進(jìn)行分組：①陰性對(duì)照組；②TGF-B1處理組（0.05、0.5、5、10ng/ml，48h）；@TGF-B

2、15ng/ml處理組（12、24、48、72h）；@TGF-B15ng/ml處理組（3、6、12、24、48h）。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變，電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)果改變。免疫熒光、Western Blot及RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞α-SMA、E-cadherin、vimentin、fibroneetin及CTGF蛋白或mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)
　　 二、A549細(xì)胞分組：①陰性對(duì)照組；②TGF-B1處理組（5ng/ml）（作用時(shí)間5、

3、30、60min）；⑨TGF-B15ng/ml處理組（作用時(shí)間6、24h）。Western Blot方法檢測(cè)Erk1/2、p-Erk1/2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)，real time-PCR法檢測(cè)Snail mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一、A549細(xì)胞經(jīng)TGF-B1作用后，相差顯微鏡觀察到細(xì)胞形態(tài)由圓形變成狹長紡錘形；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特有的嗜鋨性板層小體消失。免疫熒光、WesternBlot、RT-PCR法均顯示

4、，與陰性對(duì)照組相比，TGF-B1組隨TGF-B1作用濃度時(shí)間的增加，vimentin、fibronectin、a-SMA及CTGF蛋白或mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05），而E-cadherin表達(dá)顯著降低。實(shí)驗(yàn)二、與陰性對(duì)照組比較，Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示TGF-B1組Erk1/2磷酸化水平顯著升高（P<0.05），但無p-STAT3蛋白表達(dá)；Realtime PCR法檢測(cè)Snail mRNA水平顯著升高（P<0.05

5、）。
　　 結(jié)論：TGF-B1可在體外以濃度和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生EMT，其機(jī)制可能與上調(diào)Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及上調(diào)Snail轉(zhuǎn)錄因子水平有關(guān)，本研究未證實(shí)與STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　 二、IL-4、IFN-r對(duì)Ⅱ型肺泡上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制探討
　　 目的：探討白介素4（IL-4）、r干擾素（IFN-r）對(duì)Ⅱ型肺泡上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，及與胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（

6、Erk1/2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）、鋅指蛋白Snail的關(guān)系。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一、體外培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（A549）并分組：①陰性對(duì)照組；②陽性對(duì)照組：TGF-B1組（5ng/ml，48h）；③IL-4組（1，10，20，100，200ng/ml；48h），④IL-4組（200ng/ml；24h、48h、72h）；⑤TGF-B1（Sng/m1）+IL-4（1，10，20，100，200ng/ml；48h

7、）組。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，免疫熒光和WesternBlot法檢測(cè)各組細(xì)胞α-SMA、E-cadherin、vimentin及fibronectin蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢CTGF mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二、分組：①正常對(duì)照組；②陽性對(duì)照組：TGF-B1組（5ng/ml）；③IFN-r組（200ng/m）；④TGF-B1（5ng/ml）+IFN-r（10，100，200ng/ml）組；⑤TGF-B1（5ng/ml）+IL-4（200

8、ng/ml）+IFN-r（200ng/ml）組，作用時(shí)間12h、48h。免疫熒光、Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞E-cadherin、vimentin、fibronectin、a-SMA蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)三、分組：①正常對(duì)照組；②陽性對(duì)照組：TGF-B1組（5ng/m1）；③TGF-B1（5ng/ml）+IL-4（20ng/ml）組；④TGF-B1（5ng/ml）+IFN-r（200

9、ng/ml）組；⑤TOF-B1（5ng/ml）+IFN-r（200ng/ml）+IL-4（20ng/ml）組。分別作用5、30、60min和6、24h，Western Blot法檢測(cè)Erk1/2、P-Erk1/2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)，real time-PCR法檢測(cè)Snail mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一、與陰性對(duì)照組相比，相差顯微鏡觀察IL-4處理組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；免疫熒光、Western Blot結(jié)

10、果顯示vimentin、fibronectin、a-SMA及E-cadherin蛋白表達(dá)無顯著變化（P>0.05）。與陽性對(duì)照組相比，IL-4+TGF-B1組vimentin、fibronectin、a-SMA蛋白表達(dá)和CTGF mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05），但E-cadherin無明顯減弱（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)二、免疫熒光、Western Blot和RT-PCR顯示，與陽性對(duì)照組相比，IFN-r+TGF-B1組vimentin

11、、fibronectin、a-SMA及CTGF蛋白或mRNA水平表達(dá)顯著降低（P<0.05），而E-cadherin無明顯升高（P>0.05）；IL-4+IFN-r+TGF-B1組vimentin、fibronectin、a-SMA及CTGF蛋白或mRNA水平表達(dá)顯著升高（P<0.05），E-cadherin顯著降低（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)三、Western Blot和Real time PCR法檢測(cè)顯示，與陽性對(duì)照組相比，IL-4+TG

12、F-B1組Erk1/2磷酸化水平無顯著升高（P>0.05）；IFN-r+TGF-B1組Erk1/2和STAT3磷酸化水平均顯著升高（P<0.05）；IFN-r+IL-4+TGF-B1組Snail mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）。
　　 結(jié)論1、單獨(dú)IL-4作用不能引起EMT發(fā)生。但I(xiàn)L-4可增強(qiáng)TGF-B1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生的EMT，其機(jī)制可能與上調(diào)Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路無關(guān)。
　　 2、IFN-r可呈劑量依賴