Stat3對Snail的調(diào)控及在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)生以鱗癌為主。由于侵襲轉(zhuǎn)移是大部分食管鱗癌患者死亡的主要原因，所以探討食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對于食管鱗癌的治療及預(yù)后至關(guān)重要。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，是指上皮細(xì)胞在一些生理或病理因素的影響下失去細(xì)胞的頂面-底面極性和細(xì)胞間的連接作用，發(fā)生細(xì)胞骨架重組，促使有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有侵襲和遷移能力的成纖維樣

2、細(xì)胞的過程。EMT主要有以下幾個(gè)特征：下調(diào)上皮性標(biāo)志物，如，E-cadherin、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)等；上調(diào)某些間質(zhì)性標(biāo)志物的表達(dá)，如，Vimentin、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Fibronectin等；細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，由鵝卵石樣的形態(tài)演變?yōu)榧忓N形的纖維細(xì)胞態(tài)，使細(xì)胞獲得了游走和遷移能力，具有了間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特性，所以更有利于細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)。EM

3、T是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵一步，同時(shí)也是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制。
　　 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators oftranscription3， Stat3)是一種存在于胞漿的、與酪氨酸磷酸化信號通道相偶聯(lián)的蛋白，是1994年在肝細(xì)胞中作為IL-6信號傳遞中的急性期反應(yīng)因子(acute-phaseresponse factor, APRF)被純化的Stats家族中的重要一員，

4、能夠被多種細(xì)胞因子、生長因子和癌蛋白激活。一些研究顯示Stat3是EMT發(fā)生過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，但有關(guān)Stat3調(diào)控EMT的機(jī)制尚不清楚。有研究表明，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的Stat3可能通過對下游眾多基因如Snail，Twist的調(diào)控在EMT中發(fā)揮重要作用。但Stat3是否通過調(diào)節(jié)Snail的表達(dá)在食管鱗癌EMT中發(fā)揮作用，目前對此尚無報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)組已證明Stat3與食管鱗癌EMT的發(fā)生有關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)Stat3是否通過

5、調(diào)節(jié)Snail引發(fā)EMT，本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了以下研究。1)采用免疫組化技術(shù)檢測食管鱗癌組織中Snail蛋白的表達(dá)，分析Snail和活化的Stat3蛋白分別與E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性；2)轉(zhuǎn)染Stat3并用IL-6刺激，觀察食管鱗癌細(xì)胞株EC-1中活化的Stat3、Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)的變化；3)將SnailsiRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的食管鱗癌細(xì)胞株EC

6、-1，觀察Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)的變化；4)采用Boydenchamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的食管鱗癌細(xì)胞株EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后細(xì)胞體外侵襲能力及運(yùn)動能力的變化。
　　 材料和方法:
　　 1．采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測80例手術(shù)切除的食管鱗癌組織及其癌旁正常粘膜中Snail蛋白的表達(dá)情況。
　　 2．采用RT-PCR、We

7、stem-blot法檢測轉(zhuǎn)染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6刺激后的食管鱗癌細(xì)胞株EC-1中活化的Stat3、Snail、E-cadherin和Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 3．采用RNA干擾技術(shù)將設(shè)計(jì)合成的Snail siRNA轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1中，特異性沉默細(xì)胞中Snail基因的表達(dá)。
　　 4．采用RT-PCR、Western-blot法檢測穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的

8、EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后0h、24h、48h、72h細(xì)胞中Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)的變化。
　　 5．采用Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后0h、24h、48h、72h細(xì)胞體外侵襲能力的變化。
　　 6．采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后24h、48h、

9、72h細(xì)胞體外運(yùn)動能力的變化。
　　 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS17.0軟件分析，計(jì)量資料采用X-±S，均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析；計(jì)數(shù)資料采用陽性率，陽性率間比較采用x2檢驗(yàn)，陽性率間相關(guān)性比較采用Pearson's相關(guān)分析。以α=0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1．食管鱗癌組織中Snail蛋白的陽性表達(dá)率(73.8％)明顯高于正常食管黏膜(30.0％)(P＜0.01)。Snail蛋白

10、表達(dá)與浸潤深度有關(guān)，深層浸潤組Snail蛋白陽性表達(dá)率明顯(79.7％)高于淺層浸潤組的陽性表達(dá)率(50.0％)(P＜0.05)；Snail蛋白表達(dá)與病理分級有關(guān)，Ⅲ級(95.2％)陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ級(47.4％)陽性表達(dá)率(P＜0.01)；Snail蛋白表達(dá)與性別(P＞0.05)、年齡(P＞0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。
　　 2.食管鱗癌組織中Snail與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.30i，

11、P＜0.05)，與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.241,P＜0.05)；活化的Stat3與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.506，P＜0.05)，與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.321,P＜0.05)；Snail表達(dá)與活化的Stat3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.396,P＜0.01)。
　　 3．pXJ40-Stat3-Flag轉(zhuǎn)染EC-1并用IL-6刺激，RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)

12、染pXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激組細(xì)胞中活化的Stat3和SnailmRNA和蛋白表達(dá)分別為Stat3:0.72±0.01vs0.72±0.03；Snail:0.60±0.02vs0.78±0.03。與IL-6刺激組(Stat3:0.57±0.02vs0.65±0.01；Snail:0.50±0.04vs0.70±0.02)、Stat3轉(zhuǎn)染組(Stat3:0.65±0.01vs0.54±0.01；Snail:0.36±0

13、.02vs0.60±0.05)、空載體組(Stat3:0.59±0.03vs0.52±0.04；Snail:0.36±0.03vs0.58±0.04)、空白組(Stat3:0.57±0.04vs0.53±0.05；Snail:0.38±0.02vs0.57±0.02)相比明顯升高(P＜0.01)；Stat3mRNA在Stat3轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)高于IL-6刺激組、空載體組和空白組(P＜0.05)；Stat3mRNA在IL-6刺激組、空載體組

14、和空白組中表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)；活化的Stat3蛋白在IL-6刺激組細(xì)胞中表達(dá)高于Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白組(P＜0.05)；SnailmRNA和蛋白在IL-6刺激組細(xì)胞中表達(dá)高于Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白組(P＜0.05)。
　　 4．EC-1轉(zhuǎn)染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6刺激，RT-PCR和Westem-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激組細(xì)胞中E

15、-cadherinmRNA和蛋白為036±0.03和0.43±0.02，明顯低于IL-6刺激組(0.42±0.03vs0.51±0.02)、Stat3轉(zhuǎn)染組(0.53±0.02vs0.54±0.04)、空載體組(0.52±0.02vs0.54±0.03)和空白組(0.51±0.04vs0.53±0.02)(P＜0.01)中的表達(dá)；E-cadherinmRNA和蛋白在IL-6刺激組細(xì)胞中表達(dá)低于Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白組(P＜0.

16、05)；E-cadherinmRNA和蛋白在Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組與空白組中表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 5．EC-1轉(zhuǎn)染pXJ40-Stat3-Flag并用IL-6活化后，RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pXJ40-Stat3-Flag并IL-6刺激組細(xì)胞中Vimentin mRNA和蛋白為074±0.02和0.74±0.04，明顯高于IL-6刺激組(0.63±0.04vs0.60±0.01

17、)、Stat3轉(zhuǎn)染組(0.54±0.03vs0.52±0.02)、空載體組(0.56±0.02vs0.49±0.04)和空白組(0.56±0.01vs0.50±0.03)(P＜0.01)中的表達(dá)；Vimentin mRNA和蛋白在IL-6刺激組細(xì)胞中表達(dá)高于Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組和空白組(P＜0.05):VimentinmRNA和蛋白在Stat3轉(zhuǎn)染組、空載體組與空白組中表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 6．穩(wěn)定高表

18、達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)染SnailsiRNA后，RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組SnailmRNA表達(dá)量均顯著低于陰性對照組、空載體組和空白組，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸降低(24h0.64±0.03vs0.67±0.05、0.67±0.05、0.69±0.02,48h0.53±0.03vs0.69±0.03、0.68±0.03、0.70±0.03，72h0.43±0.04vs0.68±0.06、0.6

19、5±0.04、0.68±0.03)CP＜0.05)；轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組E-cadherin mRNA的表達(dá)量與各對照組相比明顯升高，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸升高(24h0.46±0.03vs0.39±0.06、0.39±0.04、0.40±0.04,48h0.53±0.04vs0.40±0.03、0.38±0.03、0.39±0.03，72h0.62±0.02vs0.36±0.02、0.35±0.03、0.38

20、±0.03)(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組Vimentin mRNA的表達(dá)量與各對照組相比明顯降低(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染后48h和72h Vimentin mRNA表達(dá)量明顯低于24h(24h0.69±0.04vs0.77±0.05、0.78±0.07、0.80±0.06，48h0.60±0.05vs0.79±0.03、0.79±0.04、0.77±0.03，72h0.60±0.06vs0.78±0.05、0

21、.76±0.03、0.79±0.05)(P＜0.05)，但轉(zhuǎn)染后72h與48h相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 7．穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后，Western-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組Snail蛋白表達(dá)量均顯著低于各個(gè)對照組，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸降低(24h0.68±0.03vs0.73±0.03、0.73±0.02、0.72±0.04，48h0.

22、61±0.03vs0.72±0.02、0.74±0.03、0.70±0.01,72h0.53±0.02vs0.71±0.02、0.69±0.03、0.70±0.02)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組E-cadherin的蛋白表達(dá)量均顯著高于各對照組，并且72hE-cadherin蛋白的表達(dá)量最高(24h0.61±0.02vs0.51±0.08、0.51±0.05、0.50±0.04，48h0.63±0.04vs0.

23、48±0.04、0.54±0.03、0.48±0.02，72h0.74±0.02vs0.52±0.04、0.53±0.03、0.54±0.04)CP＜0.05)。轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組Vimentin的蛋白表達(dá)量均顯著低于各對照組，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸降低(24h0.59±0.02vs0.62±0.02、0.64±0.02、0.63±0.03,48h0.52±0.02vs0.64±0.02、0.63±0.02、

24、0.62±0.02,72h0.43±0.02vs0.63±0.01、0.64±0.04、0.60±0.02)(P＜0.05)。
　　 8．穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)染Snail siRNA后，Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，干擾組與各個(gè)對照組相比，穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)均明顯減少，并且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長穿越的細(xì)胞數(shù)逐漸減少(0h107.33±7.37vs107.67±

25、5.51、111.67±11.02、108.5(±9.16,24h92.67±5.46vs110.66±11.37、113.23±1.15、110.33±3.06，48h68.33±5.69vs114.00±3.61、111.34±4.93、107.00±16.82，72h53.67±7.77vs112.66±3.51、107.06±1.53、104.33±7.09)(P＜0.05)。
　　 9．穩(wěn)定高表達(dá)Stat3的EC-1轉(zhuǎn)

26、染Snail siRNA后，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h和72h后，干擾組與各個(gè)對照組相比，遷移的距離明顯縮短(48h0.22±0.01vs0.31±0.02、0.29±0.03、0.30±0.01，72h0.24±0.01vs0.42±0.03、0.40±0.04、0.41±0.05)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1．食管鱗痛組織中Snail蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并與食管鱗癌的發(fā)生及高侵襲力相關(guān)；Snail與

27、E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)。Snail可能參與了食管鱗癌的EMT過程。
　　 2．轉(zhuǎn)染并激活Stat3可以上調(diào)Snail的表達(dá)，并導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)、Vimentin表達(dá)上調(diào)；Snail siRNA能夠成功的沉默食管鱗癌細(xì)胞Snail的表達(dá)，并且上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin表達(dá)。Snail誘導(dǎo)的EMT可能與Stat3信號蛋白有關(guān)。Stat3可能通過調(diào)節(jié)