葉酸受體介導(dǎo)負(fù)載阿霉素納米膠束FOLATE-PEG-PDLLA-DOX表征及體外試驗(yàn)研究.pdf

1、引言： 原發(fā)性肝癌，是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居癌癥死亡率第二位，且近年來有上升趨勢。由于肝癌細(xì)胞對放療的不敏感性，手術(shù)和化療是目前醫(yī)學(xué)界最主要的治療方式。而相當(dāng)大部分的肝癌患者已處于中晚期，喪失了最佳手術(shù)機(jī)會。 許多化療抗癌藥物，往往因其靶向性差、半衰期短、毒副反應(yīng)大而療效欠佳?？拱┧幬锇邢蛐圆?，以致其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對人體正常細(xì)胞如造血細(xì)胞、消化道黏膜細(xì)胞等也有很大的損害，造成骨髓抑制等嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，使

2、相當(dāng)一部分患者因難以承受而拒絕或放棄治療。傳統(tǒng)化療藥物半衰期短，致使化療藥物無法在腫瘤病灶內(nèi)較高且有效的聚集。因此，如何既高效、特異的殺傷腫瘤細(xì)胞，又最少程度的損害正常細(xì)胞組織一直受到醫(yī)學(xué)界的高度重視。長期以來，醫(yī)學(xué)界一直希望通過腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞蛋白表達(dá)差異，從而有效識別區(qū)分腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞，而大量文獻(xiàn)表明，葉酸受體在上皮細(xì)胞來源腫瘤呈過表達(dá)狀態(tài)，而正常組織細(xì)胞表達(dá)較少，由于葉酸本身的無免疫原性，高生物相容性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及造價成本低廉

3、等優(yōu)點(diǎn)，使其成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。 納米生物技術(shù)是指用于研究生命現(xiàn)象的納米技術(shù)，在醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用前景，目前主要集中在納米載體、納米藥物等方面。納米載體是指利用天然高分子或合成的化合物質(zhì)為載體制成固態(tài)高分子載藥微粒，直徑10～1000nm之間，藥物或MRI對比劑等物質(zhì)可包埋或溶解在納米粒子的內(nèi)部，也可吸附或耦合在其表面。納米藥物具有很多優(yōu)點(diǎn)，如可靶向給藥、半衰期長、穩(wěn)定性好、毒副作用小等，主要應(yīng)用于抗腫瘤等藥物的靶向給藥。

4、 納米膠束是一種多功能復(fù)合納米粒子，它是利用兩親嵌段共聚物與自組裝技術(shù)制備而成，具有表面親水、內(nèi)部疏水的獨(dú)特殼—核結(jié)構(gòu)，其親水性的外殼使膠束能夠高度分散于機(jī)體水溶性內(nèi)環(huán)境并隨血液循環(huán)傳輸?shù)教囟ú课?，而其疏水性?nèi)核則可以充當(dāng)疏水性藥物控制釋放的“納米藥庫”。通過聚合物兩親比例的控制，納米膠束可控制在10～200nm范圍內(nèi)，高分子藥物可通過疏水作用而方便的包埋入膠束的內(nèi)核，這些特點(diǎn)使其類似于一些天然的高效生物傳輸系統(tǒng)如脂蛋白和病毒等

5、。納米膠束可通過靜脈注射參與血液循環(huán)，穿過粘膜組織，其合適的納米尺寸(10～200nm)，有利于減少腎臟的排泄清除、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收和吞噬細(xì)胞的識別，從而延長在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高半衰期。由于腫瘤組織自身的特征，如血管網(wǎng)豐富、血管內(nèi)皮疏松、淋巴管缺乏等，使得納米粒子容易從血管中進(jìn)入腫瘤組織而不易被淋巴管吸收返回至血液循環(huán)，通過這種增強(qiáng)的滲透及保留作用，聚合物膠束在腫瘤局部獲得了獨(dú)特的被動靶向聚集功能。另外，納米膠束通過被動靶向運(yùn)輸及控制

6、釋放，可減少藥物與正常組織或細(xì)胞接觸，從而減少毒副作用。所以，利用納米膠束進(jìn)行抗癌藥物的傳輸已經(jīng)成為一個熱門的研究領(lǐng)域。 研究目的： 本研究通過制備外部能耦連葉酸且內(nèi)部能高效負(fù)載抗腫瘤藥物的兩親聚合物納米膠束載體PEG—PDLLA，通過體外實(shí)驗(yàn)初步探討其表征、控釋性能、靶向吸收效率及細(xì)胞毒性四方面的特性，探討PEG—PDLLA納米膠束作為藥物靶向輸送載體對肝細(xì)胞癌的靶向化療作用，探索一種靶向性高、控釋性強(qiáng)、毒副作用小的藥

7、物傳輸系統(tǒng)，從而為肝癌的靶向化療提供新的途徑和模式。 研究方法： (1)納米膠束表征通過多步驟化學(xué)反應(yīng)及自組裝技術(shù)合成兩親聚合物納米膠束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX，通過紫外分光光度儀檢測器檢測其藥物負(fù)載量；通過動態(tài)光散射分析其膠束粒徑。 (2)體外釋放實(shí)驗(yàn) 將膠束溶解入一定透析分子量的透析袋中，兩端扎緊封閉，放入裝有一定體積ph值PBS緩沖液的燒杯中．然后將燒杯放入落地式恒溫振蕩器中，通過模

8、仿人體內(nèi)環(huán)境條件，在37±0.5℃每分鐘恒溫振藥75次．每隔一定的時間間隔取出透析袋外析出的DOX溶液，并準(zhǔn)確加等量PBS溶液．利用分光光度計測定DOX吸收度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程折算出藥物濃度。釋藥結(jié)束后，收集透析帶中殘留膠束，測定殘留藥量驗(yàn)證其釋藥效果。以累計釋放藥量對時間作圖，繪制藥物在兩種PH下釋放曲線圖． (3)靶向吸收的體外實(shí)驗(yàn)研究 取對數(shù)生長期的Bel7402肝癌細(xì)胞株，分四組： A組為靶向組，加入FOLATE

9、—PEG—PDLLA—DOX；B組為非靶向組，加入PEG—PDLLA—DOX；C組為競爭抑制組，加入游離葉酸及FOLATE—PEG—PDLLA—DOX；D組為對照組，僅加入PBS溶液。共孵育后利用DOX本身具有的熒光性質(zhì)，在熒光倒置顯微鏡下觀察并攝片。其中C組通過體外競爭抑制實(shí)驗(yàn)，核實(shí)葉酸在靶向腫瘤細(xì)胞的作用． 步驟同前，用0.25％胰酶消化，用流式細(xì)胞儀檢測樣品。檢測各組的平均熒光強(qiáng)度及熒光陽性細(xì)胞百分比，進(jìn)一步檢測其各組納米

10、膠束的吸收效率。 (4)細(xì)胞毒性研究 取對數(shù)生長期的Bel7402肝癌細(xì)胞株，分四組： A組靶向組(加入FOLATE—PEG—PDLLA—DOX)，B組非靶向組(加入PEG—PDLLA—DOX)，C組膠束組(FOLATE—PEG—PDLLA+FREE DOX)，D組DOX組(加入游離DOX)。用MTT實(shí)驗(yàn)，在微孔板酶標(biāo)儀于490 nm波長處測吸收光度，計算殺傷率：殺傷率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A490/對照孔A490)×100％，

11、以spss11.0統(tǒng)計軟件計算IC50。A組與B組比較探測靶向組與非靶向組細(xì)胞殺傷區(qū)別，C組與D組比較探測空白膠束毒性試驗(yàn)，A組與D組比較探測游離藥物與負(fù)載藥物的靶向納米細(xì)胞殺傷差別。 結(jié)果： 1、表征：通過多步驟化學(xué)反應(yīng)及自組裝技術(shù)成功合成FOLATE—PEG—PELLA—DOX，其膠束粒徑60.6±1.8nm，載藥量4.8±0.2％，包封率24.0±1.2％。 2、體外釋放實(shí)驗(yàn)： FOLATE—PE

12、G—PDLLA—DOX中DOX釋放具備明顯的緩釋性能，其釋放時間超過40天，其40天時釋放約75.24％；其釋放曲線包括兩個釋放期相，前6天呈明顯快速釋放，隨后進(jìn)入持續(xù)緩慢釋放期；在兩種不同ph值的釋放曲線中，膠束在ph=5.0 PBS緩沖液中釋放速度明顯超過在ph=7.4 PBS緩沖液． 3、靶向吸收效率研究： (1)平均熒光強(qiáng)度：靶向組16.38±0.4146；非靶向組8.04±0.3989；競爭抑制組9.636±0

13、.2505。有葉酸耦聯(lián)的靶向組熒光強(qiáng)度明顯較無葉酸膠束的非靶向組增高，說明有葉酸耦聯(lián)的膠束更多量的進(jìn)入了細(xì)胞，通過LSD—單因素方差分析，靶向組熒光強(qiáng)度高于非靶向組，二者具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)；靶向組亦明顯高于競爭抑制組，二者具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。 (2)熒光細(xì)胞百分比：靶向組為0.9959±0.0026；非靶向組為0.4434±0.0085；競爭抑制組為0.6176±0.0278。通過基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)，靶

14、向組高于非靶向組，p<0.05；靶向組亦高于競爭抑制組，p<0.05)。 4、細(xì)胞毒性研究： 靶向組細(xì)胞抑制率明顯高于非靶向組，二者具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，說明耦連葉酸的靶向制劑可有效促進(jìn)了吸收效率；DOX組與膠束組細(xì)胞抑制率相當(dāng)，二者無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)，說明空白膠束無細(xì)胞毒性。 結(jié)論： 1、通過多步驟化學(xué)反應(yīng)及自組裝技術(shù)可成功合成納米膠束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX，其粒徑

15、僅約60nm，載藥率及包封率較高。 2、葉酸受體介導(dǎo)的納米膠束FOLATE—PEG—PDLLA—DOX中DOX釋放行為具有明顯的控釋性；并且具有PH值敏感性，在ph5.0的酸性環(huán)境中DOX釋放明顯較ph7.4的環(huán)境中增快，提示在人體內(nèi)靶向吸收到細(xì)胞內(nèi)的膠束DOX釋放較細(xì)胞外釋放增快。 3、FOLATE—PEG—PDLLA—DOX具備明顯的肝癌細(xì)胞靶向作用，吸收效率較無耦連葉酸的非靶向PEG—PDLLA—DOX明顯增高；競