糖尿病大鼠腎組織NOS-NO、ECE-1-ET-1MMP-9-TIMP-1的動(dòng)態(tài)變化及苯那普利對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、研究背景和目的： 近年來隨著糖尿病患者壽命的延長和發(fā)病率的增加，起病于青少年期而發(fā)病于成人期的糖尿病腎病(Diabeticnephropathy，DN)發(fā)病率也在逐漸增加，并且已成為導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。由于DN起病隱匿，臨床一旦出現(xiàn)大量蛋白尿，腎臟損害往往難以逆轉(zhuǎn)，患者很快即進(jìn)入尿毒癥期，需要長期透析維持生命；透析治療不僅給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其預(yù)后也較非糖尿病患者差，病死率高。因此，從兒童期開始積極開展DN

2、發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究、降低成人期尿毒癥的發(fā)生率，已成為國際國內(nèi)兒科腎臟病領(lǐng)域急需解決的難題。 DN早期的病理特征表現(xiàn)為腎小球“三高”(高內(nèi)壓、高濾過、高灌注)、腎小球肥大，繼而腎小球系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前的研究顯示該疾病的發(fā)生發(fā)展與血糖升高、血液動(dòng)力學(xué)改變及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)生成增多、降解減少等因素密切相關(guān)。高血糖是DN發(fā)

3、生最主要的環(huán)境因素，其所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致DN發(fā)生的基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮功能之一是維持血管收縮和舒張的平衡，而一氧化氮(Nitricoxide，NO)和內(nèi)皮素(Endothelin，ET)這一對互為拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)，是協(xié)調(diào)血管張力的關(guān)鍵，二者在調(diào)節(jié)腎小球血液動(dòng)力學(xué)和ECM積聚方面起重要作用，但他們在DN中的變化和變化機(jī)制以及其與DN發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍然存在很大分歧。 NO是一種半衰期短且化學(xué)性質(zhì)極其活潑的內(nèi)皮源性舒張因子，

4、兼有信使、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞毒性等多種作用。一氧化氮合酶(NOS)是內(nèi)源性NO合成的主要限速酶，分三種亞型，即神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、誘生型NOS(iNOS)。研究表明DN早期的高濾過與NO的變化有關(guān)，但具體與哪種NOS引起的NO改變有關(guān)，尚無定論。體外研究表明NO可抑制系膜細(xì)胞合成和分泌ECM，具有抗細(xì)胞增殖作用，但NO在腎組織中的變化與DN時(shí)ECM積聚的關(guān)系尚不十分明確。 ET-1是目前已知作用極強(qiáng)和

5、持久的一種縮血管物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其對腎小球出球小動(dòng)脈較入球小動(dòng)脈收縮明顯，從而可引起腎小球血液動(dòng)力學(xué)改變。同時(shí)，體外研究證實(shí)ET-1還是一種腎臟生長因子，可促進(jìn)ECM合成，引起ECM積聚。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(endothelinconvertingenzyme，ECE)是膜結(jié)合Ⅱ型金屬蛋白酶，有ECE-1、ECE-2、ECE-3三種異構(gòu)體，其中ECE-1在ET-1生物合成中起關(guān)鍵作用。體外研究結(jié)果顯示，高糖可增加內(nèi)皮細(xì)胞ECE-1c的表達(dá)導(dǎo)致E

6、T-1合成增加。而在糖尿病同一動(dòng)物模型中，腎組織ET-1的改變是否與ET-1mRNA和ECE-1mRNA表達(dá)均同步，ET-1含量、基因表達(dá)和ECE-1mRNA表達(dá)是否均與DN時(shí)ECM積聚有關(guān)，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 近來研究表明，DN時(shí)ECM的積聚又與其降解減少密切相關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmatalloproteinases，MMPs)是ECM降解的重要酶之一，其活性除了受其基因表達(dá)的影響外，還會(huì)受到基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制

7、因子(tissueinhibitorsofmatrixmetalloproteinases，TIMPs)的調(diào)節(jié)。MMP-9是MMPs的主要成員之一，主要降解Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原，以及纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和明膠(geltin)。TIMP-1是MMP-9特異性的組織抑制因子。體外研究結(jié)果顯示，ECM的積聚可能與高糖誘導(dǎo)的MMPs/TIMPs比例失調(diào)有關(guān)。有關(guān)MMP-9/TIMP-1在DN發(fā)病機(jī)制中的作用近來雖受到學(xué)術(shù)

8、界的關(guān)注，但報(bào)道較少，尤其在同一動(dòng)物中同時(shí)從基因表達(dá)和生物活性水平動(dòng)態(tài)觀察MMP-9和TIMP-1在DN發(fā)生發(fā)展中的作用，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACEI)類藥物，可有效降低糖尿病患者微量白蛋白尿的程度，延緩糖尿病腎功能減退的速度和向終末期腎病(ESRD)的發(fā)展。但具體作用機(jī)制尚未充分闡明，既往研究主要集中在其對

9、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-AngiotensinSystem，RAS)本身引起腎小球血流動(dòng)力學(xué)和ECM積聚的調(diào)節(jié)，而對RAS以外其他因子如NO、ET-1和MMPs/TIMPs引起的腎臟ECM積聚的研究，尤其是因ECM降解減少引起的ECM積聚的研究甚少報(bào)道。 為此，本研究應(yīng)用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察腎組織中NOS/NO、ECE-1/ET-1、MMP-9/TIMP-1

10、的表達(dá)及生物活性，同時(shí)觀察腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化，檢測Ⅳ-C在腎組織中的表達(dá)，分析它們之間的相關(guān)關(guān)系，探討NOS/NO、ECE-1/ET-1、MMP-9/TIMP-1在DN發(fā)生發(fā)展中的作用，并觀察胰島素和ACEI-苯那普利治療后上述指標(biāo)的變化，闡述高血糖在DN中的作用和苯那普利對DN保護(hù)作用的可能機(jī)制。 研究方法： 1.建立糖尿病大鼠模型：健康雄性Wistar大鼠110只，體重220克-250克，隨機(jī)分為正常對照

11、組(NC組，n=32只)和糖尿病模型組(n=78只)。糖尿病模型采用一次性腹腔注射STZ60mg/kg，3d后測定血糖，取在整個(gè)病程中血糖≥16.7mmol/L者定為糖尿病大鼠。將造模成功的72只糖尿病模型組大鼠隨機(jī)分為單純糖尿病組(DM組)、胰島素治療組(DI組)和苯那普利治療組(DL組)。DI組于造模成功后持續(xù)給予皮下注射胰島素2U/次，每日2次(早、晚各一次)治療至實(shí)驗(yàn)終止；DL組則應(yīng)用苯那普利10mg/kg·d進(jìn)行治療性灌胃至2

12、0周實(shí)驗(yàn)終止。最后NC組和DM組分別于1周、4周、12周、20周，DI組于4周、12周、20周，DL組于20周均各取8只進(jìn)行下述指標(biāo)檢測。 2.血、尿生化指標(biāo)的檢測：血清血糖(Glu)，血肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)，尿肌酐(Ucr)均用日立7170-A型全自動(dòng)生化分析儀測定；24小時(shí)尿蛋白定量(Upro)測定采用磺柳酸法。根據(jù)Scr、Ucr和24小時(shí)尿量計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Clearanceofcreatinine，Ccr

13、)，結(jié)果用體重校正。 3.腎組織形態(tài)學(xué)檢查：①蘇木素-伊紅(HematoxinEosin，HE)染色，光鏡下主要觀察腎小球大小、分辨細(xì)胞種類；②過碘酸雪夫氏反應(yīng)(PeriodicAcidSchiff，PAS)染色，光鏡下觀察系膜基質(zhì)及基底膜的變化；③透射電鏡下觀察系膜基質(zhì)、基底膜及足突改變并利用計(jì)算機(jī)圖像分析儀，測定腎小球基底膜平均厚度(GBM厚度)。 4.腎組織Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測：采用親合素-生物素

14、復(fù)合物(Avidin-BiotinComplex，ABC)染色、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色法。 5.腎組織NO、NOS活性和ET-1含量和MMP-9活性的測定：腎組織NO含量采用硝酸還原酶法測定，NOS活性采用吸光度比較法測定，ET-1含量采用放射免疫法測定，MMP-9活性采用明膠酶譜分析法檢測。 6.腎組織nNOS、eNOS、iNOS和ET-1、ECE-1以及MMP-9、TIMP-1m

15、RNA表達(dá)：采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶聯(lián)反應(yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測。 研究結(jié)果： 1.各組大鼠體重、腎重/體重、血糖和尿量的改變：與同期NC組比較，DM組和DL組大鼠腎重/體重、血糖和尿量明顯增加，而體重明顯下降，均為P＜0.01；同期DL組與DM組比較，上述指標(biāo)均無差異，P＞0.05。隨著病程的延長，DM組大鼠體重逐漸下降，而腎重/體重逐漸升

16、高，P＜0.05。與DM組比較，DI組大鼠體重明顯增加，而血糖、尿量和腎重/體重明顯下降；DI組與同期NC組比較，除體重存在差異外P＜0.01，其余指標(biāo)均無差異，P＞0.05。 2.各組大鼠腎功能的改變：與同期NC組比較，DM組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、Ccr、BUN均明顯升高，P＜0.05，且24小時(shí)尿蛋白排泄量、BUN隨病程延長逐漸增加，P＜0.05，而Ccr在自第1周時(shí)開始增加，4周時(shí)達(dá)最高值，后逐漸下降，但仍高于正常，P＜

17、0.05。與同期DM組比較，DI組和DL組上述指標(biāo)均明顯下降，P＜0.01。 3.各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變：與同期NC組比較，DM組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，光鏡下可見腎小球增大，毛細(xì)血管擴(kuò)張，系膜細(xì)胞增殖，系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞空泡和顆粒變性，間質(zhì)灶性纖維化，腎小管萎縮，小動(dòng)脈管壁增厚、變性；電鏡下可見上皮細(xì)胞足突肥大、增寬、融合，系膜基質(zhì)增多，系膜插入，基底膜增厚、分層，隨著病程的延長上述改變逐漸加重。