以ABCA1為靶點(diǎn)的新型抗動脈粥樣硬化藥物篩選模型的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是缺血性心腦血管疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，而外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝障礙是動脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)制。過量膽固醇從肝外組織中的清除是預(yù)防和治療AS的關(guān)鍵步驟。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員之一，是一種重要的以ATP為能源轉(zhuǎn)運(yùn)各種離了、脂類等細(xì)胞代謝物的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCA1可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至貧脂或無脂的載脂蛋白A-I(apoA-I)，從而促進(jìn)高密度脂蛋白(HDL)生成，啟

2、動膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程，在機(jī)體清除多余脂質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用。ABCA1基因突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的HDL缺乏綜合癥-Tangier Disease(TD)，患者以血漿HDL及apoA-I嚴(yán)重缺乏和組織巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯增多為主要特征，常伴有高膽固醇血癥、心血管疾病和AS。對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明ABCA1過度表達(dá)使apoA-I介導(dǎo)的膽固醇流出明顯增加，血漿HDL水平顯著升高，而且ABCA1蛋白水平與膽固醇流出增加及HDL水平升高明顯相關(guān)。因此，以

3、ABCA1為靶點(diǎn)篩選得到其表達(dá)上調(diào)劑，不僅將加深我們對真核牛物ABCA1基因表達(dá)調(diào)控及其牛物學(xué)意義的理解，揭示膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而且對新型抗動脈粥樣硬化藥物的開發(fā)也具有指導(dǎo)意義。 為了尋找能夠提高ABCA1表達(dá)水平的活性化合物，本工作構(gòu)建了一個新穎的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的高通量篩選模型。將在熒光素酶報(bào)告基因上游克隆有ABCA1基因上游調(diào)控序列的重組質(zhì)粒pGL3-ABCA1與pcDNA3共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，經(jīng)Gg18篩選得

4、到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，命名為ABCA1-LUC HepG2細(xì)胞。以9-順式-視黃酸為陽性對照，利用ABCA1-LUC HepG2胞株建立了ABCA1表達(dá)上調(diào)劑篩選模型。對該模型進(jìn)行了條件優(yōu)化和高通量篩選適應(yīng)性評價(jià)，結(jié)果表明所選的文獻(xiàn)報(bào)道陽性藥物在此基于細(xì)胞的高通量篩選模型中都呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系和較高的信噪比，而且用于評價(jià)模型穩(wěn)定性的參數(shù)Z'因子>0.5，從而證明了所建模型具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。應(yīng)用本模型對4000個微生物發(fā)酵液粗提物和2

5、200個天然產(chǎn)物與合成化合物進(jìn)行了8200樣次的篩選，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得了具有ABCA1表達(dá)上調(diào)活性的3個陽性菌株和7陽性個化合物。對兩株陽性菌株I05-1143和I05-1743進(jìn)行了生物學(xué)鑒定、發(fā)酵條件摸索和發(fā)酵液活性成分的分離與性質(zhì)的初步研究。從I05-1743發(fā)酵液中得到一個活性組分，命名為組分1743A；從I05-1143發(fā)酵液分離得到的一個單體化合物1143A，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，確證1143A為4’,7-二羥基異黃酮，與已

6、知化合物大豆素結(jié)構(gòu)相同。對篩選得到的4個天然活性產(chǎn)物：吡咯霉素(2006-F7)、阿克拉霉素(2008-F4)、大豆素(1143A)和紅車軸草素(4776B)進(jìn)行了分子藥理學(xué)及細(xì)胞水平牛物活性研究。研究結(jié)果表明吡咯霉素、阿克拉霉素、大豆素和紅車軸草素都能在微摩爾濃度下上調(diào)ABCA1的轉(zhuǎn)錄活性，最大上調(diào)倍數(shù)在1.8～2.5倍之間。采用Real-time quantitative RT-PCR和Western blot方法進(jìn)一步證實(shí)了4個活

7、性化合物對HepG2細(xì)胞中ABCA1轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。利用小鼠單核-巨噬細(xì)胞RAW264.7泡沫化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吡咯霉素、阿克拉霉素、大豆素和紅車軸草素對巨噬細(xì)胞的泡沫化具有一定的抑制作用。 本研究首次構(gòu)建了適于高通量篩選的ABCA1表達(dá)上調(diào)劑篩選模型，通過篩選和分離純化獲得了8個具有上調(diào)ABCA1表達(dá)活性的化合物，并在分子和細(xì)胞水平確證了其牛物學(xué)活性，為尋找新型抗動脈粥樣硬化藥物或其先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)使利用小分了化