ABCA1為靶點促膽固醇外排藥物的篩選.pdf

1、目的:
　　 動脈粥樣硬化的主要的細胞學改變是動脈內(nèi)膜的巨噬細胞及平滑肌細胞中大量膽固醇的聚集,形成泡沫化細胞。對于大多數(shù)細胞來說,基本都不代謝膽固醇或僅少部分轉(zhuǎn)變成氧化固醇,因此需要某種機制將細胞內(nèi)多余的膽固醇轉(zhuǎn)移出細胞。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)是機體排出多余膽固醇的唯一途徑,RCT是指將肝外細胞及組織中的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟,并進一步通過膽汁、糞便排出體外的過程。在此過程中ABCA1是介導膽固醇及磷脂轉(zhuǎn)運至含apoA-Ⅰ脂蛋白的

2、主要轉(zhuǎn)運體,因此具有重要的抗AS作用。ABCA1蛋白水平維持在一穩(wěn)定水平,對ABCA1的功能的增強或抑制的調(diào)節(jié)主要在其基因啟動子上。LXR、RXR、PPARs與其共激活因子共同作用結(jié)合至ABCA1啟動子上相應順式作用元件可上調(diào)ABCA1的表達。因此,LXR或者RXR等轉(zhuǎn)錄因子的小分子激活劑可成為上調(diào)ABCA1促膽固醇外排的一類藥物。然而,LXR激動劑引起SREBP1c靶基因的上調(diào),結(jié)果導致嚴重的脂肪肝以及高甘油三酯血癥。因此,篩選直接作

3、用于ABCA1新型促膽固醇外排的藥物已成為抗AS藥物的研究重點。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建ABCA1啟動子的報告基因:以小鼠基因組DNA為模板,克隆小鼠ABCA1基因啟動子序列(-636 to+208 bp),將該片段插入到含螢火蟲熒光素酶報告基因的質(zhì)粒pGL3-Basic中,得到含小鼠ABCA1啟動子序列的重組質(zhì)粒。
　　 2.上調(diào)ABCA1藥物的篩選:通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒pGL3-PA1與內(nèi)參質(zhì)粒

4、phRL-TK共轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中。通過對報告基因系統(tǒng)優(yōu)化后,利用該系統(tǒng)對人工合成的126個黃酮類、42個姜黃素類衍生物及部分上市的抗AS藥物進行篩選。在藥物作用24小時后,利用雙報告基因檢測試劑檢測熒光素酶的活性。
　　 3.為了進一步證實報告基因系統(tǒng)中候選化合物上調(diào).ABCA1啟動子的活性,采用實時定量RT-PCR和Western-Blot的方法檢測部分候選化合物對ABCA1的mRNA水平及蛋白質(zhì)水平的影響。

5、>　　 4.F87與F90對RAW264.7細胞中3H標膽固醇外排作用:oxLDL與3H標膽固醇共荷脂RAW264.7細胞24小時后,F87與F90再作用于荷脂RAW264.7細胞24小時,最后通過液體閃爍計數(shù)分別檢測apoA-Ⅰ與HDL介導的膽固醇外排率。
　　 5.F87與F90上調(diào)ABCA1啟動子活性的機制:構(gòu)建小鼠ABCA1啟動子截斷片段及LXRE突變的報告基因,利用雙報告基因系統(tǒng)檢測F87與F90在ABCA1啟動子報

6、告基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 6.F90對小鼠在體中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的作用:24只C57BL/6小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)3周,同時給予F90干預。之后,小鼠腹腔注射oxLDL及3H標膽固醇荷脂的RAW264.7細胞。第24小時,第48小時取血,液閃計數(shù)檢測放射性活性。收集48小時內(nèi)所有的糞便,液體閃爍計數(shù)檢測放射性活性。最后取出肝臟,稱量部分肝臟用于液閃計數(shù)檢測放射性活性。第48小時取的血清用于酶法分析血脂。
　　 7.F90對小

7、鼠在體中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的作用:實時定量PCR檢測肝臟及小腸內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達水平。
　　 8.阿司匹林上調(diào)ABCA1表達促進apoA-Ⅰ介導的RAW264.7細胞膽固醇的外排:定量PCR及Western Blot檢測ABCA1的表達,檢測阿司匹林對apoA-Ⅰ及β-MCD誘導RAW264.7細胞膽固醇外排的作用,PPARα-SiRNA轉(zhuǎn)染細胞后檢測RAW264.7細胞中ABCA1的表達及apoA-Ⅰ介導的膽固醇外

8、排。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究成功構(gòu)建了含小鼠ABCA1啟動子序列(-636 to+208 bp)的熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒pGL3-PA1。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中,作為篩選藥物的工具。
　　 2.從126個合成的黃酮類、姜黃素及42個姜黃素衍生物中,我們發(fā)現(xiàn)在1.0×10-6M的濃度下,合成黃酮類中的F72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M10

9、3,姜黃素衍生物中D191和218能明顯提高pGL3-PA1質(zhì)粒的ABCA1啟動子活性。上市抗AS藥物中,我們發(fā)現(xiàn)1.0×10-6M的辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀以及0.5mM的阿司匹林也能輕度地上調(diào)ABCA1啟動子的活性。
　　 3.我們采用定量RT-PCR分析部分候選化合物對RAW264.7細胞ABCA1的mRNA水平的作用,發(fā)現(xiàn)其上調(diào)ABCA1 mRNA的作用跟其在雙報告基因系統(tǒng)中上調(diào)ABCA1啟動子活性的作用基本一致。我

10、們發(fā)現(xiàn)F87和F90上調(diào)ABCA1的mRNA水平的作用比陽性藥LXR激動劑GW3965的作用要強。通過Western-Blot分析,我們發(fā)現(xiàn)F87和F90呈劑量依賴性上調(diào)ABCA1的蛋白水平,同時對另一轉(zhuǎn)運體ABCG1也有劑量依賴性地上調(diào)作用。
　　 4.F87和F90劑量依賴性地增強apoA-Ⅰ及HDL誘導RAW264.7細胞中3H標膽固醇的外排。
　　 5.F87和F90明顯增加含LXRE報告基因的活性,而對LXRE

11、突變的報告基因的活性沒有作用。
　　 6.與對照組相比,F90明顯降低小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。在注射細胞48小后,F90明顯降低血清中3H標膽固醇的水平,但肝臟中及糞便中的放射性活性呈劑量依賴性地增高。
　　 7.F90劑量依賴性增加小鼠肝臟中ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8與CYPA7的mRNA水平；F90劑量依賴性增加小鼠小腸中ABCA1、ABC

12、G1、ABCG5與ABCG的mRNA水平。
　　 8.阿司匹林能上調(diào)RAW264.7細胞ABCA1的表達及apoA-Ⅰ介導的膽固醇外排,而對β-MCD誘導的RAW264.7細胞膽固醇外排無明顯影響,PPARα特異性干擾可抑制以上效應。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了pGL3-PA1雙報告基因篩藥系統(tǒng),可用于從眾多合成小分子化合物中篩選出上調(diào)小鼠ABCA1啟動子活性藥物的有力工具。
　　 2.黃酮類化合物F

13、72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M103,姜黃素衍生物D191和218能明顯提高pGL3-PA1質(zhì)粒的ABCA1啟動子活性。
　　 3.F87和F90可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細胞ABCA1的mRNA水平,且作用比陽性藥LXR激動劑GW3965的作用強。F87和F90可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細胞ABCA1與ABCG1的蛋白水平。
　　 4.F87和F90劑

14、量依賴性地增強apoA-Ⅰ及HDL誘導RAW264.7細胞中3H標膽固醇的外排。
　　 5.F87和F90上調(diào)ABCA1啟動子的活性與LXRE有關(guān)。
　　 6.F90明顯降低小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,促進體內(nèi)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運。
　　 7.F90具有上調(diào)小鼠肝臟及小腸中膽固醇外排相關(guān)基因表達的作用。擬作為治療AS的先導化合物申請知識產(chǎn)權(quán)保護,并計劃進一