ABCA1為靶點(diǎn)促膽固醇外排藥物的篩選.pdf

1、目的:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化的主要的細(xì)胞學(xué)改變是動(dòng)脈內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中大量膽固醇的聚集,形成泡沫化細(xì)胞。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來說,基本都不代謝膽固醇或僅少部分轉(zhuǎn)變成氧化固醇,因此需要某種機(jī)制將細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇轉(zhuǎn)移出細(xì)胞。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)是機(jī)體排出多余膽固醇的唯一途徑,RCT是指將肝外細(xì)胞及組織中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟,并進(jìn)一步通過膽汁、糞便排出體外的過程。在此過程中ABCA1是介導(dǎo)膽固醇及磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至含apoA-Ⅰ脂蛋白的

2、主要轉(zhuǎn)運(yùn)體,因此具有重要的抗AS作用。ABCA1蛋白水平維持在一穩(wěn)定水平,對(duì)ABCA1的功能的增強(qiáng)或抑制的調(diào)節(jié)主要在其基因啟動(dòng)子上。LXR、RXR、PPARs與其共激活因子共同作用結(jié)合至ABCA1啟動(dòng)子上相應(yīng)順式作用元件可上調(diào)ABCA1的表達(dá)。因此,LXR或者RXR等轉(zhuǎn)錄因子的小分子激活劑可成為上調(diào)ABCA1促膽固醇外排的一類藥物。然而,LXR激動(dòng)劑引起SREBP1c靶基因的上調(diào),結(jié)果導(dǎo)致嚴(yán)重的脂肪肝以及高甘油三酯血癥。因此,篩選直接作

3、用于ABCA1新型促膽固醇外排的藥物已成為抗AS藥物的研究重點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建ABCA1啟動(dòng)子的報(bào)告基因:以小鼠基因組DNA為模板,克隆小鼠ABCA1基因啟動(dòng)子序列(-636 to+208 bp),將該片段插入到含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒pGL3-Basic中,得到含小鼠ABCA1啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒。
　　 2.上調(diào)ABCA1藥物的篩選:通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒pGL3-PA1與內(nèi)參質(zhì)粒

4、phRL-TK共轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中。通過對(duì)報(bào)告基因系統(tǒng)優(yōu)化后,利用該系統(tǒng)對(duì)人工合成的126個(gè)黃酮類、42個(gè)姜黃素類衍生物及部分上市的抗AS藥物進(jìn)行篩選。在藥物作用24小時(shí)后,利用雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑檢測(cè)熒光素酶的活性。
　　 3.為了進(jìn)一步證實(shí)報(bào)告基因系統(tǒng)中候選化合物上調(diào).ABCA1啟動(dòng)子的活性,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western-Blot的方法檢測(cè)部分候選化合物對(duì)ABCA1的mRNA水平及蛋白質(zhì)水平的影響。

5、>　　 4.F87與F90對(duì)RAW264.7細(xì)胞中3H標(biāo)膽固醇外排作用:oxLDL與3H標(biāo)膽固醇共荷脂RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)后,F87與F90再作用于荷脂RAW264.7細(xì)胞24小時(shí),最后通過液體閃爍計(jì)數(shù)分別檢測(cè)apoA-Ⅰ與HDL介導(dǎo)的膽固醇外排率。
　　 5.F87與F90上調(diào)ABCA1啟動(dòng)子活性的機(jī)制:構(gòu)建小鼠ABCA1啟動(dòng)子截?cái)嗥渭癓XRE突變的報(bào)告基因,利用雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)F87與F90在ABCA1啟動(dòng)子報(bào)

6、告基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 6.F90對(duì)小鼠在體中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的作用:24只C57BL/6小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)3周,同時(shí)給予F90干預(yù)。之后,小鼠腹腔注射oxLDL及3H標(biāo)膽固醇荷脂的RAW264.7細(xì)胞。第24小時(shí),第48小時(shí)取血,液閃計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性活性。收集48小時(shí)內(nèi)所有的糞便,液體閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性活性。最后取出肝臟,稱量部分肝臟用于液閃計(jì)數(shù)檢測(cè)放射性活性。第48小時(shí)取的血清用于酶法分析血脂。
　　 7.F90對(duì)小

7、鼠在體中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的作用:實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝臟及小腸內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　 8.阿司匹林上調(diào)ABCA1表達(dá)促進(jìn)apoA-Ⅰ介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞膽固醇的外排:定量PCR及Western Blot檢測(cè)ABCA1的表達(dá),檢測(cè)阿司匹林對(duì)apoA-Ⅰ及β-MCD誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞膽固醇外排的作用,PPARα-SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)及apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇外

8、排。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究成功構(gòu)建了含小鼠ABCA1啟動(dòng)子序列(-636 to+208 bp)的熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pGL3-PA1。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,作為篩選藥物的工具。
　　 2.從126個(gè)合成的黃酮類、姜黃素及42個(gè)姜黃素衍生物中,我們發(fā)現(xiàn)在1.0×10-6M的濃度下,合成黃酮類中的F72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M10

9、3,姜黃素衍生物中D191和218能明顯提高pGL3-PA1質(zhì)粒的ABCA1啟動(dòng)子活性。上市抗AS藥物中,我們發(fā)現(xiàn)1.0×10-6M的辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀以及0.5mM的阿司匹林也能輕度地上調(diào)ABCA1啟動(dòng)子的活性。
　　 3.我們采用定量RT-PCR分析部分候選化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞ABCA1的mRNA水平的作用,發(fā)現(xiàn)其上調(diào)ABCA1 mRNA的作用跟其在雙報(bào)告基因系統(tǒng)中上調(diào)ABCA1啟動(dòng)子活性的作用基本一致。我

10、們發(fā)現(xiàn)F87和F90上調(diào)ABCA1的mRNA水平的作用比陽性藥LXR激動(dòng)劑GW3965的作用要強(qiáng)。通過Western-Blot分析,我們發(fā)現(xiàn)F87和F90呈劑量依賴性上調(diào)ABCA1的蛋白水平,同時(shí)對(duì)另一轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG1也有劑量依賴性地上調(diào)作用。
　　 4.F87和F90劑量依賴性地增強(qiáng)apoA-Ⅰ及HDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中3H標(biāo)膽固醇的外排。
　　 5.F87和F90明顯增加含LXRE報(bào)告基因的活性,而對(duì)LXRE

11、突變的報(bào)告基因的活性沒有作用。
　　 6.與對(duì)照組相比,F90明顯降低小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。在注射細(xì)胞48小后,F90明顯降低血清中3H標(biāo)膽固醇的水平,但肝臟中及糞便中的放射性活性呈劑量依賴性地增高。
　　 7.F90劑量依賴性增加小鼠肝臟中ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8與CYPA7的mRNA水平；F90劑量依賴性增加小鼠小腸中ABCA1、ABC

12、G1、ABCG5與ABCG的mRNA水平。
　　 8.阿司匹林能上調(diào)RAW264.7細(xì)胞ABCA1的表達(dá)及apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇外排,而對(duì)β-MCD誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞膽固醇外排無明顯影響,PPARα特異性干擾可抑制以上效應(yīng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了pGL3-PA1雙報(bào)告基因篩藥系統(tǒng),可用于從眾多合成小分子化合物中篩選出上調(diào)小鼠ABCA1啟動(dòng)子活性藥物的有力工具。
　　 2.黃酮類化合物F

13、72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M103,姜黃素衍生物D191和218能明顯提高pGL3-PA1質(zhì)粒的ABCA1啟動(dòng)子活性。
　　 3.F87和F90可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細(xì)胞ABCA1的mRNA水平,且作用比陽性藥LXR激動(dòng)劑GW3965的作用強(qiáng)。F87和F90可劑量依賴性地上調(diào)RAW264.7細(xì)胞ABCA1與ABCG1的蛋白水平。
　　 4.F87和F90劑

14、量依賴性地增強(qiáng)apoA-Ⅰ及HDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中3H標(biāo)膽固醇的外排。
　　 5.F87和F90上調(diào)ABCA1啟動(dòng)子的活性與LXRE有關(guān)。
　　 6.F90明顯降低小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平,促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 7.F90具有上調(diào)小鼠肝臟及小腸中膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)的作用。擬作為治療AS的先導(dǎo)化合物申請(qǐng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù),并計(jì)劃進(jìn)一