新型ABCA1、SR-BI-CLA-1表達(dá)上調(diào)劑的抗動脈粥樣硬化活性及其作用靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、心血管疾病在發(fā)達(dá)國家和大多數(shù)發(fā)展中國家是危害人類健康的主要殺手，而動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種嚴(yán)重心血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS的病理生理過程主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損以及巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞在血管壁的沉積形成泡沫細(xì)胞，從而使動脈血管壁不斷加厚，最終引起動脈粥樣硬化。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和清道夫受體B型Ⅰ（scavenge

2、r receptor class B typeⅠ，SR-BⅠ）是介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白，在機(jī)體清除多余脂質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要功能。人的高密度脂蛋白受體被稱作CLA-1。ABCA1和SR-BⅠ/CLA-1被認(rèn)為是預(yù)防或治療動脈粥樣硬化的潛在靶標(biāo)。
　　實驗室前期在已有的ABCA1、CLA-1表達(dá)上調(diào)劑篩選模型上得到了活性化合物吳茱萸次堿(Rutaecarpine，RUT)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RUT在體內(nèi)能通過上調(diào)ABCA1、SR-B

3、Ⅰ起到抗AS的作用。RUT是瞬時受體電位香草醛亞家族1(TransientReceptor Potentialcation channel subfamily V member1，TRPV1)的激動劑。近些年有研究表明，TRPV1與動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病有著密切的關(guān)系。Ma等的研究結(jié)果表明，激活TRPV1能夠上調(diào)ABCA1的表達(dá)，減緩AS的發(fā)生發(fā)展。因此，TRPV1可能是位于ABCA1、SR-BI/CLA-1上游的作用靶標(biāo)。<

4、br>　　鑒于ABCA1、SR-BI/CLA-1在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展以及治療中的重要作用，我們進(jìn)行了 ABCA1、SR-BI/CLA-1表達(dá)上調(diào)劑的抗動脈粥樣硬化活性研究，及其上游作用靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的機(jī)制研究。
　　1.ABCA1、CLA-1表達(dá)上調(diào)劑的發(fā)現(xiàn)
　　本論文首先以實驗室前期構(gòu)建的ABCA1和CLA-1表達(dá)上調(diào)劑篩選模型為基礎(chǔ)，進(jìn)行了大規(guī)模的化合物篩選，以期發(fā)現(xiàn)能夠提高ABCA1、CLA-1表達(dá)水平的活性化合物。應(yīng)用此

5、模型對化合物庫中的化合物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了活性化合物E0869;針對合成的RUT衍生物進(jìn)行了篩選，獲得了活性化合物R20。
　　2.E0869體外抗動脈粥樣硬化活性研究
　　Western blot和RT-PCR實驗表明，活性化合物E0869能上調(diào)肝細(xì)胞HepG2中ABCA1、CLA-1以及ABCG1的mRNA以及蛋白水平，但不影響FAS、SREBP-1c的表達(dá)。E0869能上調(diào)巨噬細(xì)胞RAW264.7中ABCA1、SR-B

6、1以及ABCG1的mRNA以及蛋白水平，但不影響CD36的表達(dá)。巨噬細(xì)胞泡沫化實驗表明，E0869能使泡沫化巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)脂滴量明顯減少，膽固醇流出實驗結(jié)果表明，E0869能增加其膽固醇的流出。
　　3.R20的抗動脈粥樣硬化活性研究及其作用靶標(biāo)研究
　　Western blot和RT-PCR實驗表明，R20能上調(diào)肝細(xì)胞HepG2中ABCA1、CLA-1以及ABCG1的mRNA以及蛋白水平，但不影響FAS、SR

7、EBP-1c的表達(dá)。巨噬細(xì)胞泡沫化實驗表明，R20能使泡沫化巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)脂滴量明顯減少，膽固醇流出實驗結(jié)果表明，R20能增加其膽固醇的流出。
　　R20是本實驗室合成的RUT的衍生物，RUT是TRPV1的激動劑，文獻(xiàn)表明激活TRPV1能夠上調(diào)ABCA1的表達(dá)，與動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病有著密切的關(guān)系。所以，R20有可能是通過激活TRPV1來上調(diào)ABCA1的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗AS的作用。為了進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，

8、我們構(gòu)建了人TRPV1激動劑篩選模型，以進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和檢測。通過檢測我們發(fā)現(xiàn)R20在人TRPV1激動劑篩選模型上表現(xiàn)出了良好的活性。
　　同時，我們對R20進(jìn)行了初步的體內(nèi)活性研究，apoE-/-小鼠實驗結(jié)果表明，R20還能夠顯著降低小鼠血清中TC、TG以及LDL-C的含量，對HDL-C的含量有一定的升高作用。此外，R20能夠顯著上調(diào)小鼠肝臟中ABCA1、SR-B1、ABCG1以及LDLR的蛋白及mRNA水平，但對FAS、SR

9、EBP-1c的表達(dá)有一定的抑制作用;R20還能顯著減輕肝臟中的脂質(zhì)堆積。
　　綜上所述，本論文通過ABCA1、CLA-1表達(dá)上調(diào)劑篩選模型進(jìn)行篩選，獲得了兩個活性化合物E0869和R20，我們進(jìn)一步對E0869、R20在細(xì)胞水平確證了其藥效學(xué)活性。為了尋找ABCA1、CLA-1表達(dá)上調(diào)劑作用靶標(biāo)，我們構(gòu)建了人TRPV1激動劑篩選模型，通過檢測我們發(fā)現(xiàn)R20具有良好的激動活性。同時，我們對活性較好的R20進(jìn)行了初步的體內(nèi)活性研究。本