富血小板血漿對牙周膜成纖維細(xì)胞在病變牙根表面的附著及膠原形成的研究.pdf

1、目的：研究不同濃度的富血小板血漿(Platelate-Rich plasma,PRP)對牙周膜成纖維細(xì)胞(Peridontal fibroblasts,PDLFs)在脫礦的病變牙根表面的附著，以及富血小板血漿對牙周膜成纖維細(xì)胞在脫礦的病變牙根表面形成膠原的影響。以進(jìn)一步探討富血小板血漿在促牙周組織再生中的作用。 方法：采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，取5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。富血小板血漿的制備采用二步密度梯

2、度離心法，取人新鮮全血(已加入抗凝劑)第一次離心(1300r/min)10分鐘，吸取全部上清液及交界面以下1～2mm的沉淀部分移至另一離心管，棄去下層沉淀部分，再次離心(2000r/min)10min，獲取下層為富血小板血漿(PRP)，棄去上層為貧血小板血漿(PPP)。將制備一部分富血小板血漿吸取于EP管，貯存在-20℃環(huán)境下，為實(shí)驗(yàn)處理脫礦根片時(shí)備用，將另一部分制備的富血小板血漿與10％CacL2和牛凝血酶以9:1(V/V)混合，4℃

3、冰箱過夜，待血凝塊充分收縮后，低溫下，再次離心(10000r/min)10分鐘，吸取上清液于EP管，貯存在-20℃環(huán)境下，用于調(diào)節(jié)不同濃度的PRP備用。病變牙根片的制備，取因重度牙周病拔除的病牙，拔除前用鉛筆在牙根表面標(biāo)記出牙周袋累及的范圍，然后用刮治器刮凈牙根面上殘留的組織，并在冷水冷卻的條件下用金剛砂片將牙根磨成4×4mm2大小，1mm厚(只磨出牙本質(zhì)側(cè)，牙骨質(zhì)側(cè)不磨)的牙根片，收集的根片經(jīng)高壓處理后留存待用。處理的脫礦病變牙根片，

4、根片的處理方法是EDTA(24％，PH=6.7)脫鈣加PRP5μl包被。本實(shí)驗(yàn)主要分兩部分來完成：1、檢測不同濃度PRP對入PDLFs在處理的脫礦病變牙根表面的附著情況。實(shí)驗(yàn)分組：(1)實(shí)驗(yàn)組A組10％PRP培養(yǎng)基、B組15％PRP培養(yǎng)基、C組20％PRP培養(yǎng)基、D組30％PRP培養(yǎng)基；(根片均用PRP5μl包被)(2)對照組E組DMEM培養(yǎng)基(根片無PRP包被)。首先將脫礦的病變牙根片用雙面膠固定在96孔培養(yǎng)板中，按實(shí)驗(yàn)分組分別預(yù)處理

5、收集的病變牙根片，紫外線照射30分鐘，然后加入2×105/ml細(xì)胞的相應(yīng)培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育4h后，采用四唑鹽比色法[3-(4，5-dimethyiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]測定細(xì)胞附著情況。方法是每孔加入20μlMTT，繼續(xù)孵育4h，吸棄孔內(nèi)上清液，輕輕取去牙骨質(zhì)塊，用PBS液輕輕漂洗兩次，另置于96孔板，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5分鐘，酶標(biāo)儀

6、測定各孔OD值。2、觀察富血小板血漿對牙周膜成纖維細(xì)胞在脫礦的病變牙根表面膠原的形成情況。將處理的脫礦病變牙根片固定在48孔培養(yǎng)板中，然后加入含3×104細(xì)胞濃度懸液的相應(yīng)培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組：(1)實(shí)驗(yàn)組A組20％PRP培養(yǎng)基(根片包被約PRP5μl)。(2)對照組B組DMEM培養(yǎng)基(根片無PRP包被)，繼續(xù)培養(yǎng)2周，每2-3天按相應(yīng)培養(yǎng)液換液。2周后對兩組實(shí)驗(yàn)采用掃描電鏡觀察細(xì)胞在病變根片表面附著，生長狀態(tài)以及膠原形成的情況。用天狼星紅