NF-kB誘捕ODNs抑制肺成纖維細胞膠原形成的實驗研究.pdf

1、肺成纖維細胞膠原分泌增加，導致細胞外基質(zhì)過度沉積是肺纖維化(PulmonaryFibrosis,PF)的主要病理形態(tài)學改變，其分泌的膠原主要是Ⅰ型和Ⅲ型。肺成纖維細胞膠原分泌增加是肺纖維化的關鍵環(huán)節(jié)，減少肺成纖維細胞膠原表達被認為是治療肺纖維化的有效方式。細胞因子網(wǎng)絡在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要而復雜的作用，在各種細胞因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TransformingGrowthFactor-β1,TGF-β1)對肺成纖維細胞膠

2、原分泌的影響作用最大。因此該信號傳導途徑在肺纖維化中的作用成為近年研究熱點。 核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)能與多種細胞因子上游啟動子的特定結合位點作用，從而調(diào)節(jié)多種細胞因子的基因表達。NF-κB對TGF-β1基因表達的上調(diào)作用已在多個實驗研究中得到證實，鑒于TGF-β在肺纖維化中的重要作用，通過抑制NF-κB的活性，來抑制TGF-β信號傳導途徑對肺成纖維細胞膠原分泌的上調(diào)作用，從而減少肺成纖維細胞

3、的膠原分泌，可望成為肺纖維化的有效治療策略。 本研究目的是通過陽離子脂質(zhì)體介導的NF-κB誘捕寡核苷酸策略(decoy-oligonu--cleotides，DecoyODNs)抑制體外肺成纖維細胞NF-κB的活性，觀察肺成纖維細胞的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達量變化情況，為肺纖維化治療探索新的治療途徑。 本課題進行了以下兩個方面的研究：1、應用肺組織塊法、差時貼壁法原代培養(yǎng)、純化小鼠肺成纖維細胞，TGF-β5ng/ml刺激后

4、用ODNs-脂質(zhì)體復合物進行干預，采用凝膠電泳阻滯法(Electro-phoreticMobilityShiftAssay,EMSA)檢測不同劑量及不同時間點條件下NF-κB的活性變化；2.通過RT-PCR反應檢測NF-κB活性被抑制后肺成纖維細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達量。 主要結果： 1.應用肺組織塊法及差時貼壁法相結合原代培養(yǎng)小鼠肺成纖維細胞，得到高純度肺成纖維細胞。 2.用EMSA檢測NF-κB活性

5、證實，與對照組比較，decoyODN-脂質(zhì)體復合物干預肺成纖維細胞后，NF-κB的活性明顯下降(P＜0.05)。decoyODN濃度為2μg/ml時，NF-κB活性有所下降，不具統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，濃度為4μg/ml時NF-κB的活性下降(P＜0.05)，但濃度為8μg/ml時NF-κB的活性最低。decoyODN干預2小時后即可觀察到NF-κB的活性下降，24小時后NF-κB的活性仍未恢復。 3.通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反

6、應(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)反應檢測NF-κB活性被抑制后肺成纖維細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達量顯示，NF-κB活性被抑制后，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達量均下降(P＜0.05)，其表達量與NF-κB活性程度呈正相關。decoyODN干預后2小時，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原mRNA表達量下降不明顯，干預后6小時，膠原mRNA表達量開始下降，到干預后24小時

7、，膠原mRNA表達量仍處于較低水平。 主要結論： 1.肺組織塊法與差時貼壁法結合應用可有效分離、純化小鼠肺成纖維細胞。第3～5代細胞適用于以肺成纖維細胞為觀察對象的實驗研究。 2.陽離子脂質(zhì)體介導的NF-κB誘捕寡核苷酸策略能有效抑制NF-κB的活性。相對于2μg/ml及4μg/ml，8μg/ml的decoyODN濃度對NF-κB活性的抑制作用最好。 3.decoyODN作用于肺成纖維細胞早期即發(fā)揮對NF

8、-κB的抑制作用，加入decoyODN2小時后NF-κB的活性最低，其對NF-κB的抑制作用至少持續(xù)22小時。decoyODN對NF-κB活性影響的時效關系為該方法的進一步應用提供基本數(shù)據(jù)。 4.抑制NF-κB的活性能有效減少體外肺成纖維細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達量，提示抑制NF-κB的活性可減少肺纖維化過程中細胞外基質(zhì)的沉積。 5.decoyODN作用于肺成纖維細胞6小時即可抑制膠原mRNA表達，抑制作用至少