血管鈣化相關(guān)因子在糖尿病鼠腎小動脈中的表達及其與血管內(nèi)膜-中膜增厚關(guān)系的初步探討.pdf

1、背景和研究目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，其基本病理改變公認為腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生，最終彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。糖尿病的血管病變?nèi)鐒用}粥樣硬化(Atherosclerosis，As)和血管鈣化(Vascular calcification)是糖尿病大血管并發(fā)癥研究中的焦點，尸檢發(fā)現(xiàn)腎動脈也有粥樣斑塊和鈣化，但鮮有腎臟病理學家及腎臟病學家描述或研究腎實質(zhì)內(nèi)除腎動脈外的

2、下級分支小動脈的血管鈣化早期病灶及其相關(guān)因子表達以及這些因素在DM和DN發(fā)病機制中作用的報道。本文擬通過糖尿病動物模型，連續(xù)多時點觀察核心結(jié)合因子a1(core bind factor alpha-1，Cbfa1)、骨形成蛋白2(Bonemorphogenetic protein-2，BMP-2)、基質(zhì)Gla蛋白(Matrix Gla Protein，MGP)以及單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant pr

3、otein-1，MCP-1)在糖尿病腎病鼠的腎臟實質(zhì)小動脈中的表達，并探討血管內(nèi)膜/中膜增厚與血管鈣化相關(guān)因子及炎性因子MCP-1的關(guān)系，旨在研究糖尿病腎病早期腎臟實質(zhì)小動脈中血管鈣化早期標志表達的變化規(guī)律，探討血管鈣化在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用，為糖尿病腎病的治療提供新的思路和新的靶點。 方法:雄性成年SD大鼠，標準化喂養(yǎng)。設糖尿病腎病、非洛地平干預和正常三組，每組4、8、12、16、24周5個觀察點，每時點6-7只鼠，糖尿

4、病腎病組采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射造模。處死前留尿、備血測常規(guī)生化指標，分析各指標的相關(guān)關(guān)系。采用原位雜交技術(shù)、免疫組織化學染色以及實時熒光定量(Real-time PCR)檢測腎實質(zhì)內(nèi)小動脈Cbfa1、BMP-2、MGP和MCP-1的蛋白和基因的表達，免疫熒光組化觀察內(nèi)膜/中膜厚度比，腎臟石臘切片普通病理觀察及茜素紅鈣特殊染色觀察血管鈣鹽沉積的情況。 結(jié)果:(1)Cbfa1免疫組化顯示在DN

5、組與DN-F組腎實質(zhì)小動脈上有蛋白表達(小球上有微弱表達，小管上沒有表達)，于4周開始上調(diào)，隨時間推移表達逐漸增強，24周表達最強，各時間點比較顯著高于N組，N組小動脈有弱表達，各時間點無差異；Cbfa1原位雜交結(jié)果顯示只在腎小動脈有mRNA表達，4周時有微弱表達，8周開始增強，主要表達于小動脈內(nèi)彈力層和外彈力層，24周表達最強，16、24周小動脈肌層表達亦增強，各時間點比較顯著高于N組，N組表達弱，各時間點無差異，DN組與DN-F組比

6、較無顯著差異。 (2)MGP Real-Time PCR顯示DN組與DN-F組4周表達量最高，8周稍降低，12周表達量稍有增加，16周后表達量顯著降低，24周最低，且低于N組，N組各時間點表達量無顯著差異。(3)BMP-2免疫組化顯示在DN組與DN-F組腎實質(zhì)小動脈有表達(小球上、小管有弱表達)，4周表達上調(diào)，隨時間推移表達逐漸增強，4、8周小動脈內(nèi)彈力膜表達明顯，肌層表達較弱，12周后肌層表達亦明顯增強，24周達高峰，N組小動脈上無表

7、達； Real-Time PCR顯示在DN組與DN-F組各時點BMP-2 mRNA表達量存在差異，4周表達量開始增加，12周稍下降，16、24周表達量持續(xù)增加，24周達高峰，各時間點比較明顯高于N組，N組內(nèi)比較無差異；原位雜交顯示在DN組與DN-F組BMP-2表達情況同Cbfa1原位雜交。 (4)MCP-1免疫組化顯示DN組與DN-F組在小動脈、小球及小管均有表達，小動脈4、8、12周表達無顯著差異，16、24周表達明顯上調(diào)，N組小動脈

8、及小球沒有表達，僅在小管有微弱表達；原位雜交顯示DN組與DN-F組MCP-1小動脈上有表達，4周開始有表達，8周表達增加，16、24周達高峰，DN組與DN-F組各時間點比較無顯著差異，N組腎小動脈無表達。(5)茜素紅鈣染色顯示DN組與DN-F組早期(4、8周)腎實質(zhì)小動脈上沒有鈣鹽沉積，中后期(16、24周)可見點狀甚至片狀沉積。(6)免疫熒光組化可見腎內(nèi)小動脈內(nèi)膜呈紅色熒光，中膜呈綠色熒光，第4周時，DN組及DN-F組內(nèi)膜/中膜之比與

9、N組無明顯差異，第12周時DN組及DN-F組內(nèi)摸/中膜之比高于N組，但無統(tǒng)計學意義，DN組與DN-F組間無顯著差異。第24周時DN與DN-F組內(nèi)膜/中膜之比高于N組，且有統(tǒng)計學意義。(7)DN組Cbfa1、BMP-2呈顯著正相關(guān)，它們與血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白也呈明顯正相關(guān)；Cbfa1、BMP-2與MGP呈顯著負相關(guān)，Cbfa1與MCP-1、血鈣及尿素氮呈顯著正相關(guān)；MGP與血脂、血磷、血肌酐、尿蛋白卻呈明顯負相關(guān)。BMP-2、MGP

10、與MCP-1血鈣及尿素氮無明顯相關(guān)性。小動脈內(nèi)膜/中膜之比與Cbfa1、BMP-2、MCP-1呈明顯呈正相關(guān)；與CHOL、TG呈顯著正相關(guān)：與血磷呈正相關(guān)；與血鈣呈正相關(guān)，但無統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：1．糖尿病腎病早期腎臟實質(zhì)內(nèi)小動脈存在血管鈣化的早期標志Cbfa-1的表達，且隨病程延長，促進血管鈣化因子BMP-2表達逐漸增強，抑制血管鈣化因子MGP表達減弱；2．DN腎實質(zhì)小動脈早期無鈣鹽沉積，中后期鈣鹽沉積逐漸增多；3．DN早期內(nèi)

11、膜/中膜厚度比無明顯變化，中期已有變化，后期變化明顯；4．血管鈣化前已先有鈣化形成相關(guān)因子MGP和BMP-2的表達，且MGP在血管鈣化早期表達增加，晚期表達下降，BMP-2卻在早期表達較弱，晚期表達增強，二者呈明顯負相關(guān)，提示MGP/BMP-2確是一對調(diào)節(jié)血管鈣化的并相互拮抗的因子；5．血管鈣化指標與血脂、血磷、血肌酐及炎癥因子MCP-1等有明顯相關(guān)性，說明DN早期即存在的炎癥狀態(tài)(與內(nèi)膜增厚相關(guān))及代謝紊亂可以促進腎實質(zhì)小動脈鈣化。中