鎂通過調(diào)節(jié)鈣化相關因子的表達抑制血管鈣化.pdf

1、目的:血管鈣化是慢性腎臟?。–KD）患者的常見并發(fā)癥，與心血管疾病(CVD)死亡率密切相關。眾所周知除傳統(tǒng)危險因素，非傳統(tǒng)因素，如尿毒癥毒素、礦物質(zhì)代謝紊亂，尤其是高磷血癥，在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。其中高磷可通過很多途徑誘導血管平滑肌細胞(VSMCs)發(fā)生鈣化，如血管平滑肌細胞凋亡、骨源性分化、鈣化促進因子（如:核心結合因子α-1）及抑制因子（如:基質(zhì)G蛋白;骨橋蛋白質(zhì)）的平衡紊亂等。因此由于血管鈣化發(fā)生的機制十分復雜，致

2、使目前對血管鈣化尚無有效的預防和治療方法。鎂離子作為體內(nèi)重要的陽離子對維持血管彈性和心臟節(jié)律有重要的作用，因此近年來鎂離子與血管鈣化之間的關系備受關注，有臨床研究發(fā)現(xiàn)碳酸鎂可能會抑制冠狀動脈鈣化的進展，但鎂離子和血管鈣化之間的確切關系目前尚不完全明確，因此本研究旨在探討增加鎂離子濃度后對高磷誘導血管鈣化的影響及其可能的機制。
　　方法:
　　1、VSMCs原代培養(yǎng)
　　取5周齡雄性健康SD大鼠胸主動脈通過組織貼壁法進行

3、VSMCs原代培養(yǎng)，應用形態(tài)學和免疫學方法進行平滑肌細胞鑒定。
　　2、實驗干預及分組
　　隨機將VSMCs分為4組:(1)正常對照組:加入10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基;(2)高磷組:正常培基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸（β-GP）;(3)鎂干預組:在高磷培基中加入3 mmol/L硫酸鎂(MgSO4);(4)鎂通道抑制劑(2-APB)干預組:高磷培基中加入3 mmol/L MgSO4及10-4 mol/L2-A

4、PB。各組VSMCs分別培養(yǎng)0、3、6、10、14天。
　　3、在培養(yǎng)14天后測定各組VSMCs的鈣化水平
　　各組VSMCs的鈣化染色應用茜素紅(Alizarin red stain)方法;各組VSMCs鈣含量測定應用鄰甲酚酞絡合酮比色法。
　　4、在培養(yǎng)14天后測定各組VSMCs的堿性磷酸酶(ALP)活性
　　將各組VSMCs培養(yǎng)14天后棄去其上清液，依據(jù)ALP活性試劑盒測定ALP活性，此過程嚴格按照試劑盒說

5、明書進行操作。
　　5、在不同時間點測定各組VSMCs核心結合因子α-1(Cbfα1)mRNA的表達
　　應用逆轉(zhuǎn)錄PCR分別檢測0天、3天、6天、10天、14天時正常對照組、高磷組、鎂干預組以及14天時鎂通道抑制劑干預組Cbfα1 mRNA的表達。
　　6、在不同時間點分別檢測各組VSMCs中基質(zhì)G蛋白(MGP) mRNA和骨橋蛋白質(zhì)(OPN)mRNA的表達。
　　應用RT-PCR分別檢測0天、3天、6天、10

6、天、14天時正常對照組、高磷組、鎂干預組以及14天時鎂通道抑制劑干預組VSMCs MGP mRNA和OPN mRNA的表達。
　　7、統(tǒng)計學處理
　　應用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)應用均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)差異比較應用單因素方差分析(ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較應用SNK檢驗， P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、大鼠VSMCs的原代培養(yǎng)
　　大鼠原代VSM

7、Cs采用組織塊貼壁法獲得，一般情況下動脈組織塊貼壁后約3～4天即可爬出少量細胞，細胞形狀主要為長梭形，并以束狀形式排列，組織塊貼壁6-7天后細胞融合成片，細胞形狀仍以梭形為主。當細胞處于亞融合狀態(tài)時即可傳代，傳代后的細胞開始為橢圓形或者圓形，待細胞貼壁后可逐漸伸展為梭形，細胞漿豐富，細胞核呈圓形或者卵圓形，細胞重疊生長，呈現(xiàn)出“峰-谷”樣。α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA actin)是血管平滑肌細胞特異性抗體，免疫學方法檢測的陽性結

8、果為平滑肌細胞胞漿內(nèi)強表達α-SMA actin，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色。
　　2、高鎂抑制高磷誘導的VSMCs鈣化及ALP活性
　　各組VSMCs鈣化染色結果:與正常對照組相比，高磷組可見大量橘紅色鈣鹽沉積;與高磷組相比，鎂干預組細胞鈣鹽沉積明顯減輕，鎂通道抑制劑干預組鈣鹽沉積比鎂干預組明顯增加。與鈣化染色相一致，鈣含量測定結果顯示鎂干預組明顯降低高磷誘導的鈣鹽沉積(P＜0.05），而這種作用可被2-APB抑制(P＜0.05）。

9、ALP活性測定結果顯示:鎂干預組ALP活性明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預組(P＜0.05)。
　　3、高鎂抑制高磷誘導的VSMCs中骨源性因子Cbfα1的表達，并呈時間依賴性
　　RT-PCR結果顯示，培養(yǎng)14天后，鎂干預組Cbfα1的水平明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預組(P＜0.05)。且動態(tài)觀察Cbfα1的表達變化發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第3天時，高磷組Cbfα1表達即明顯增加(P＜0.05），并隨著時間的延長呈上升趨勢;而高鎂在

10、第3天時即明顯抑制了Cbfα1表達，長期培養(yǎng)過程中其抑制效果逐漸增強。
　　4、高鎂可上調(diào)鈣化相關抑制因子MGP和OPN的表達，并呈時間依賴性
　　RT-PCR結果顯示，培養(yǎng)14天后，鎂干預組MGP mRNA和OPNmRNA的表達水平高于高磷組及鎂通道抑制劑干預組(P＜0.05）。動態(tài)觀察MGP mRNA和OPN mRNA的表達變化，結果顯示在培養(yǎng)第3天時，高磷組MGP mRNA和OPN mRNA表達水平均降低(P＜0.05

11、)，并隨著時間的延長呈下降趨勢;在培養(yǎng)第3天時，高鎂抑制了高磷誘導的MGP mRNA和OPN mRNA表達下降的作用(P＜0.05)，且長期（14天）暴露在高鎂環(huán)境中可逐漸增加MGP和OPN的表達。
　　結論:
　　1、高濃度鎂離子可抑制高磷誘導的VSMCs鈣化。
　　2、高濃度鎂離子抑制VSMCs鈣化的機制可能是通過降低Cbfα1的表達抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化，并上調(diào)內(nèi)源性鈣化相關拮抗因子MGP及OPN的表達來實現(xiàn)的，