體外轉(zhuǎn)染CyclinA2基因?qū)υ笫笮募〖?xì)胞增殖的影響.pdf

1、背景：
　　臨床上對(duì)心血管惡性事件的救治主要依賴于藥物控制和手術(shù)干預(yù)，但是從治療效果和長(zhǎng)遠(yuǎn)收益來(lái)看，心肌梗死的死亡率只是得到了暫時(shí)的控制，而心力衰竭的死亡風(fēng)險(xiǎn)卻在無(wú)形加劇。以干細(xì)胞替代治療為主的實(shí)驗(yàn)研究，近年來(lái)已廣泛開展，但仍受細(xì)胞來(lái)源、移植風(fēng)險(xiǎn)等客觀因素的影響，同時(shí)又受倫理道德等因素的約束，在臨床上尚未大規(guī)模應(yīng)用。眾所周知，成熟心肌細(xì)胞增殖能力很低，一旦受到損傷，導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞壞死，心臟功能受損甚至衰竭，若能誘導(dǎo)成熟的心肌細(xì)胞

2、進(jìn)行分裂增殖，心臟再生的難題就有望得到徹底攻克。然而有關(guān)心肌細(xì)胞增殖再生方面尚有諸多問題。CyclinA2基因作為細(xì)胞周期的一個(gè)主控因子控制著細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的及時(shí)轉(zhuǎn)換和循環(huán)往復(fù)，對(duì)細(xì)胞周期正確發(fā)揮其調(diào)控作用至關(guān)重要，對(duì)于解決心肌再生問題具有很高的研究?jī)r(jià)值。
　　目的：
　　探討體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期素A2(Cyclin A2)基因?qū)υ笫笮募〖?xì)胞增殖的影響，為心臟再生提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.心肌細(xì)胞原

3、代培養(yǎng)采用酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法，分離、培養(yǎng)、純化大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，在活細(xì)胞工作站下實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，攝片記錄原代培養(yǎng)過程中心肌細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　2.基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天，分別轉(zhuǎn)染帶有預(yù)先包裝好的攜帶目的基因Cyclin A2的重組腺病毒和僅含有綠色熒光蛋白的空病毒。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組(1)重組腺病毒Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染帶有強(qiáng)化綠色熒光蛋白(Green Fluorescent P

4、rotein，GFP)和Cyclin A2基因的重組腺病毒(Ad-Cyclin A2-GFP);(2)空病毒轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染不含目的基因僅有GFP的重組腺病毒(Ad-Null-GFP);(3)陰性對(duì)照組:未做轉(zhuǎn)染處理，僅加入等量的培養(yǎng)基。
　　4.GFP示蹤技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析評(píng)估原代大鼠心肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率;對(duì)比實(shí)驗(yàn)組（重組腺病毒Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組）和空病毒載體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率有無(wú)差異。
　　5.間接法免疫熒光雙重標(biāo)記

5、轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)體外培養(yǎng)3-5 d，利用免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)Cyclin A2、磷酸化組蛋白H3(Phosphorylates Histone H3，H3P)、心肌肌鈣蛋白-T(Cardiac Troponin T，cTnT)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞8-12h后多貼壁生長(zhǎng)，并可見單個(gè)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞，頻率約13-44次/分。3-5 d后細(xì)胞匯集成片狀，形成細(xì)胞簇或單層細(xì)胞，搏動(dòng)趨近同步性，收縮明顯有

6、力，頻率約46-182次/分。
　　2.熒光GFP示蹤表明:重組腺病毒Cyclin A2轉(zhuǎn)染組對(duì)心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率略低于空病毒轉(zhuǎn)染組，空病毒載體侵染原代大鼠心肌細(xì)胞的效率幾乎達(dá)到100％，重組腺病毒Cyclin A2侵染心肌細(xì)胞效率約為(97±0.74)％，活細(xì)胞工作站下可見轉(zhuǎn)染成功的心肌細(xì)胞顯示綠色熒光，并呈現(xiàn)簇狀搏動(dòng)。
　　3.免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白cTnT分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中不存在表達(dá);大鼠原代心

7、肌細(xì)胞純度高達(dá)(95±0.62)％;心肌細(xì)胞CyclinA2主要在胞核內(nèi)聚集，少數(shù)分布于細(xì)胞質(zhì);H3P是一種有絲分裂期的特殊標(biāo)記蛋白，以細(xì)胞核內(nèi)分布為主。
　　4.轉(zhuǎn)染Cyclin A2基因后，心肌細(xì)胞有絲分裂指數(shù)明顯增高，約為空病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的3倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); Cyclin A2基因轉(zhuǎn)染組可見大量多核細(xì)胞，以雙核為主，伴少量三核心肌細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.本研究所采用的酶聯(lián)合消