南方鲇(Silurus meridionalis)Ghrelin基因克隆及其mRNA表達(dá)研究.pdf

1、Ghelin為生長(zhǎng)激素促分泌受體第一個(gè)內(nèi)源性配體。是一條N末端第三個(gè)氨基酸被脂肪酸鏈修飾的含有28個(gè)氨基酸的核酸多肽,最早是由Kojima在小鼠胃中發(fā)現(xiàn)。Ghrelin的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了它在脊椎動(dòng)物調(diào)節(jié)能量動(dòng)態(tài)平衡中的作用,研究硬骨魚(yú)類發(fā)現(xiàn),GRln除在胃中高量表達(dá)外,在大腦、胰腺、膀胱、腸和鰓中也廣泛表達(dá)。這種廣泛性表達(dá)使其功能呈現(xiàn)多樣性,從而呈現(xiàn)出一系列的生物學(xué)作用。Ghrelin不僅能夠刺激魚(yú)類生長(zhǎng)激素的釋放,提高攝食量、引起肥胖等生物

2、學(xué)作用,還能影響多種激素釋放以及調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸。它的生物學(xué)作用主要通過(guò)與體內(nèi)的內(nèi)源性配體生長(zhǎng)激素促分泌素受體-1a(GHSR-1a)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。
　　 本研究以南方鲇為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,運(yùn)用RACE(Rapid amplification of cDNA end)技術(shù)成功克隆了南方鲇Ghrelin基因cDNA的全長(zhǎng)序列,并根據(jù)堿基序列翻譯出Ghrelin的氨基酸序列,進(jìn)而預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的基本物理性質(zhì)及高級(jí)結(jié)構(gòu)。另外,本研究還使用

3、熒光定量PCR技術(shù)(QRT-PCR)檢測(cè)南方鲇各種組織(腦、胃、肝、腎、心臟、鰓、腸)、發(fā)育階段(受精卵、囊胚,原腸胚,神經(jīng)胚和出膜)和不同攝食水平下Ghrelin的表達(dá)水平,為后續(xù)研究Ghrelin的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。
　　 通過(guò)RACE技術(shù),成功的克隆了南方鲇Ghrelin全長(zhǎng)cDNA序列。GhrelincDNA序列全長(zhǎng)473bp,包括327bp編碼區(qū)(ORF),以及一段長(zhǎng)度為45bp5'端非翻譯區(qū)(UTR)和101b

4、p3'端非翻譯區(qū)。南方鲇Ghrelin成熟肽含有22個(gè)氨基酸(“GSSFLSPSQRPQNRGDRKPPRV”)。通過(guò)對(duì)Ghrelin氨基酸的同源性比對(duì),結(jié)果顯示成熟Ghrelin多肽的N端要比C端更保守,主要為“GSSFLSP”7個(gè)氨基酸,其中“GSSF”4個(gè)氨基酸推測(cè)可能為Ghrelin的生物活性中心。比對(duì)結(jié)果還顯示Ghrelin氨基酸同硬骨魚(yú)類具有40%-81%的相似性,同哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行類、兩棲類具有32%-38%的相似性。

5、在經(jīng)過(guò)由低級(jí)向高級(jí)的進(jìn)化過(guò)程中,4個(gè)位點(diǎn)在硬骨魚(yú)類、兩棲動(dòng)物、爬行類、鳥(niǎo)類和哺乳類依然保留,說(shuō)明此位點(diǎn)在生命活動(dòng)中扮演重要的角色。
　　 經(jīng)過(guò)QPCR對(duì)南方鲇各組織的表達(dá)分析,我們發(fā)現(xiàn)Ghrelin在胃、腸中的含量相對(duì)較為豐富,這和以往研究Ghrelin在胃的基部產(chǎn)生相一致,從側(cè)面可以反映Ghrelin在攝食過(guò)程中可能起到某種生物學(xué)作用。對(duì)南方鲇不同早期發(fā)育時(shí)期檢測(cè)Ghrelin的含量變化發(fā)現(xiàn),在出膜前Ghrelin的含量相對(duì)豐

6、富,在其余不同的發(fā)育時(shí)期均微量表達(dá),并隨著時(shí)間的推移,呈上升趨勢(shì),特別卵黃消耗殆盡出膜前,Ghrelin含量明顯升高,說(shuō)明,南方鲇在出膜后各器官對(duì)營(yíng)養(yǎng)供給做出重要應(yīng)對(duì)機(jī)制,為食物由內(nèi)源性向外源性轉(zhuǎn)變做好準(zhǔn)備,Ghrelin在對(duì)外源性食物調(diào)節(jié)作用中起更重要的作用,但調(diào)節(jié)內(nèi)源性食物作用有限。對(duì)南方鲇不同攝食水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在攝食后0小時(shí),Ghrelin含量最高,攝食2小時(shí)后迅速降低,此時(shí)南方鲇胃中食物幾乎還沒(méi)有消化,我們據(jù)此推斷,Ghreli

7、n在攝食過(guò)程中的生物學(xué)作用可能僅為饑餓信號(hào)。在南方鲇饑餓48小時(shí)后,檢測(cè)Ghrelin的含量最高,然后隨饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),反而呈下降趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)饑餓2周后,當(dāng)再攝食4小時(shí)候后,Ghrelin含量又迅速降低,再攝食24小時(shí)后,Ghrelin的含量恢復(fù)到饑餓24小時(shí)Ghrelin含量的50%。綜上我們推測(cè)Ghrelin調(diào)節(jié)攝食是一個(gè)短期調(diào)節(jié)過(guò)程,并且Ghrelin的分泌可能受胃組織結(jié)構(gòu)、生理功能的影響以及分解代謝的抑制等。
　　 綜上所