基于炎性體研究單增李斯特菌致小鼠流產(chǎn)的分子機(jī)制.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria Monocytogenes，LM)簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌，寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)外，是一種重要的食源性人獸共患病病原菌，常引起人和動(dòng)物，特別是反芻動(dòng)物（如牛、羊等）的繁殖障礙，造成死胎、流產(chǎn)及胎兒感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。近些年，人們對(duì)LM感染導(dǎo)致人和動(dòng)物流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，證明LM感染引起的動(dòng)物流產(chǎn)與其誘導(dǎo)的免疫失調(diào)和細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。已知在妊娠動(dòng)物的母

2、胎界面上存在多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，這些細(xì)胞通過(guò)與存在于母胎界面滋養(yǎng)層細(xì)胞的相互作用，共同維持胚胎的正常發(fā)育、調(diào)節(jié)局部免疫的平衡和抵御外來(lái)病原的侵襲。近些年人們發(fā)現(xiàn)炎性體在介導(dǎo)局部炎性反應(yīng)、抵御外來(lái)病原的侵入等方面發(fā)揮著重要的作用，證明許多病原菌可激活宿主單核/巨噬細(xì)胞的炎性體，后者可介導(dǎo)以炎性反應(yīng)為特征的非特異免疫應(yīng)答反應(yīng)，然而過(guò)激的炎性反應(yīng)可引起組織的損傷和相關(guān)疾病的發(fā)生。同時(shí)已有研究證明LM可激活巨噬細(xì)胞的炎

3、性體，但是LM激活巨噬細(xì)胞炎性體的作用是否引起母胎界面的免疫失衡，是否影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致動(dòng)物的流產(chǎn)，目前尚不清楚。
　　為探討LM感染引起動(dòng)物流產(chǎn)的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先分析了LM感染對(duì)妊娠小鼠胚胎存活率和細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，LM感染可大幅降低胚胎的存活率，明顯提高Th1細(xì)胞因子(IL-2，INF-γ)和IL-1β表達(dá)，促進(jìn)IL-1β成熟和釋放。Th1細(xì)胞因子增加導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞因子失衡和IL-1β介導(dǎo)的

4、炎性反應(yīng)均被認(rèn)為是影響胚胎存活的重要因素。LM誘導(dǎo)IL-1β的成熟和釋放提示LM可能激活了胎盤(pán)細(xì)胞中的炎性體，為此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了妊娠小鼠胎盤(pán)組織勻漿液中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase1，caspase1)的水平，結(jié)果表明，LM可激活胎盤(pán)組織的caspase1。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用溶血素O(listeriolysin O，LLO)缺陷型的LM(LM/LLO-/-)

5、感染妊娠小鼠發(fā)現(xiàn)，LM/LLO-/-對(duì)妊娠小鼠胚胎存活率、細(xì)胞因子的表達(dá)和胎盤(pán)組織勻漿液中caspase1的水平?jīng)]有產(chǎn)生明顯的影響，表明在LM致妊娠小鼠流產(chǎn)的過(guò)程中，LLO通過(guò)激活炎性體發(fā)揮著重要作用。
　　為大量制備LLO，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因重組技術(shù)，構(gòu)建了LLO的原核分泌表達(dá)載體，利用大腸桿菌表達(dá)和制備了重組LLO。溶血試驗(yàn)檢測(cè)表明，制備的重組LLO具有明顯的溶血活性，說(shuō)明重組LLO具有生物學(xué)活性。
　　為進(jìn)一步證實(shí)LM對(duì)炎

6、性體的激活作用，本實(shí)驗(yàn)首先用LM感染小鼠巨噬細(xì)胞，證實(shí)LM可明顯促進(jìn)IL-1β表達(dá)與釋放，激活caspase1，促進(jìn)感染細(xì)胞的凋亡和壞死，表明LM可激活巨噬細(xì)胞的炎性體。為了進(jìn)一步弄清LLO在LM激活巨噬細(xì)胞炎性體的中的作用，我們用LM/LLO-/-和重組LLO處理B6巨噬細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)了LM/LLO-/-處理的細(xì)胞中組織蛋白酶B的分布，同時(shí)分析了重組LLO引起的K+外流和Ca++內(nèi)流，結(jié)果證實(shí)細(xì)胞內(nèi)LM產(chǎn)生的LLO

7、可引起吞噬體/溶酶體膜的損傷導(dǎo)致組織蛋白酶B的釋放，細(xì)胞外LLO可引起細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)K+的外流和C++的內(nèi)流，組織蛋白酶B的釋放和上述離子的流動(dòng)被認(rèn)為是NLRP3炎性體激活的重要因素。為進(jìn)一步探討LLO是否激活巨噬細(xì)胞的NLRP3炎性體，我們分別用LM/WT、LM/LLO-/-和重組LLO處理野生型和NLRP3缺陷型(NLRP3-KO)B6巨噬細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn):①LM/WT，并非LM/LLO-/-，可明顯促進(jìn)小鼠B6巨噬細(xì)胞IL-

8、1β的釋放，促進(jìn)caspase1 p10（成熟caspase1）的生成;LM/WT對(duì)NLRP3-KO B6巨噬細(xì)胞IL-1β的釋放和caspase1 p10生成的促進(jìn)作用明顯降低;②重組LLO處理后對(duì)IL-1β的釋放和caspase1 p10生成與LM/WT感染B6巨噬細(xì)胞的作用相似。上述結(jié)果表明，LM通過(guò)LLO可激活巨噬細(xì)胞的NLRP3炎性體。
　　為探討LM激活巨噬細(xì)胞炎性體是否影響對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)利用感染LM巨

9、噬細(xì)胞的培養(yǎng)基和重組小鼠IL-1β在體外處理小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，分析其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和炎性免疫應(yīng)答的影響，結(jié)果表明感染LM的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基和IL-1β均可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞基質(zhì)金屬硫蛋白酶類(lèi)(matrixmetalloproteinases，MMPs)的表達(dá)。這一結(jié)果表明，適度的IL-1β介導(dǎo)的炎性反應(yīng)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和胚胎著床是有力的，但如果炎性反應(yīng)過(guò)激，由此造成的炎性損傷作用及滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)度侵襲將會(huì)影響蛻膜的組織

10、結(jié)構(gòu)，影響胚胎著床和發(fā)育。同時(shí)，感染LM的巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基和重組IL-1β可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNFα)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的表達(dá)，從而促進(jìn)母胎界面的炎性反應(yīng)，影響胚胎的正常發(fā)育和穩(wěn)定性，這可能是LM誘發(fā)流產(chǎn)的又一重要因素。
　　總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證明LM感染可引起妊娠動(dòng)小鼠母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡，