多廿醇對(duì)3-羥3-甲基戊二酰輔酶A還原酶活性的抑制作用研究.pdf

1、目前臨床上常用他汀類藥物治療高膽固醇血癥患者，其作用機(jī)制是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使膽固醇合成關(guān)鍵酶3-羥-3-甲基戊二酸-輔酶 A 還原酶(HMG-CoA還原酶)活性降低，減少膽固醇合成，達(dá)到治療目的。由于他汀類藥物有毒副作用，不宜長(zhǎng)期服用，使高膽固醇血癥、冠心病的控制變得困難。近10多年，一種從甘蔗臘質(zhì)或蜂蜜中提取出來(lái)具有多個(gè)脂肪族伯醇的化合物--多廿醇(Policosanol)被發(fā)現(xiàn)，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)都揭示多廿醇具有降低膽固醇和抗血

2、小板的藥理作用。由于它是一種比較安全的天然化合物，我們前期的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明其毒性屬于無(wú)毒級(jí)，體內(nèi)無(wú)明顯蓄積作用，可長(zhǎng)期服用，對(duì)高膽固醇血癥、冠心病的預(yù)防和治療展示廣泛的臨床運(yùn)用前景。目前關(guān)于多廿醇的功能在臨床上已經(jīng)得到很好的研究和證實(shí)。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)都揭示多廿醇有著和他汀類相同的降膽固醇作用，能夠以更低的劑量獲得相同的甚至是更好的降血脂效果。但是，多廿醇降低膽固醇的確切機(jī)理尚未有定論。 目的 本研究采用體外細(xì)胞

3、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法，紫外分光-速率法檢測(cè)hMG-CoA還原酶活性，從而判斷受試物多廿醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA還原酶活性的抑制作用，擬探討多廿醇降膽固醇的作用機(jī)制。 方法 1、為了確定本次實(shí)驗(yàn)研究的藥物用藥劑量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)受試藥物(多廿醇)，酶活性促進(jìn)劑(胰島素)和受試藥物溶劑(乙醇)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以明確這些因素對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的直接影響程度。細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用。MTT活性細(xì)胞檢測(cè)法，此外用乳酸脫氫酶漏出率

4、反映對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的破壞程度，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)。HepG2細(xì)胞存活率。2、HMG-CoA還原酶活性測(cè)定方法建立是參考紫外分光-速率法，經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)，測(cè)定還原型輔酶Ⅱ在反應(yīng)過(guò)程中被氧化的量(340nm吸收鋒下降率)來(lái)反映HMG-CoA還原酶活性。紫外分光．速率法適用于可溶性HMG-CoA還原酶活性測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原方法進(jìn)行改進(jìn)，增加精密過(guò)濾和加凝聚劑高速離心沉降微粒體，消除比色中散射光的影響，使該方法適用于不溶性HMG-CoA還原酶活

5、性測(cè)定。 3、實(shí)驗(yàn)分組及處理以人肝癌細(xì)胞株(HepG2)為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)傳代后采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的原則進(jìn)行分組，為了觀察藥物和酶促進(jìn)劑的交互作用，多廿醇和胰島素采用正交實(shí)驗(yàn)分組，多廿醇和胰島素分組濃度參考MTT試驗(yàn)的結(jié)果。分為：對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、多廿醇組、胰島素組、多廿醇(含高、中、低)和胰島素(含高、中、低)的正交實(shí)驗(yàn)交叉濃度組，共17組。為使多廿醇的體外培養(yǎng)和體內(nèi)生化代謝過(guò)程齊同，加入含肝藥物代謝酶的S9液共同培

6、養(yǎng)。以上各組細(xì)胞在CO<,2>培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6小時(shí)，培養(yǎng)終止后收獲細(xì)胞，鈣離子梯度離心法分離微粒體，按上述紫外分光-速率法測(cè)定所分離到微粒體中的HMG-CoA還原酶活性和整體細(xì)胞中的HMG-CoA還原酶活性。 結(jié)果 1、細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)后，多廿醇0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/ml組MTT試驗(yàn)細(xì)胞抑制率分別為8.5％，19.2％和49.5％。胰島素0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/m、25μg/ml和5

7、0kμg/ml組MTT試驗(yàn)抑制率分別為+0.85％、-3.59％、-8.77％、-17.44％和+11.18％。多廿醇5μg/ml、10μg/ml、20μg/m和50μg/ml組的乳酸脫氫酶漏出分別為52.1 U／L、79.6 U/L、121.7 U/L和178.3 U/L。細(xì)胞計(jì)數(shù)存活率分別為92.2％、88.0％、80.1％和70.9％。由此可確定多廿醇受試濃度設(shè)為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml，胰島素受試濃度設(shè)為5μ

8、g/ml、10μg/ml、20μg/ml。 2、采用紫外分光-速率法用島津UV-1700儀器進(jìn)行HMG-CoA還原酶活性測(cè)定，經(jīng)過(guò)對(duì)NADPH掃描圖譜分析，不同濃度的NADPH均在340nm波長(zhǎng)處展示很好的特征吸收峰，NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線直線濃度范圍在0～0.5mmol/L之間，靈敏度為0.002 mmol/L，加標(biāo)準(zhǔn)NADPH 0．2 mM測(cè)試回收率大于97％，重現(xiàn)性均數(shù)(X)為0.1986mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)差(S)為0.002

9、8mmol/L，變異系數(shù)(CV)為1.42％，95％可信區(qū)間(0.193mmol/L，0.2041mmol/L)，NADPH在0.2 mM時(shí)自然氧化速率為0.0009/min。經(jīng)過(guò)方法改進(jìn)后，比色液澄清無(wú)混懸物，能滿足HMG-CoA還原酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)要求，克服了放射性標(biāo)記法數(shù)據(jù)變異大的缺點(diǎn)。3、多廿醇對(duì)HepG2細(xì)胞微粒體和整體細(xì)胞HMG-CoA還原酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，胰島素在5～20μg/ml范圍對(duì)HMG-CoA還原

10、酶活性均呈促進(jìn)作用，而且有濃度依賴關(guān)系。對(duì)照組比較，多廿醇在5～20μg/ml范圍對(duì)HMG-CoA還原酶活性均呈抑制作用，也有濃度依賴關(guān)系。在正交分組實(shí)驗(yàn)中，多廿醇對(duì)HMG-CoA還原酶活性的抑制作用與胰島素的促進(jìn)作用有互相抵消的趨勢(shì)，并顯示濃度依賴關(guān)系。多廿醇對(duì)HMG-CoA還原酶活性的抑制作用在HepG2細(xì)胞微粒體和HepG2細(xì)胞整體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都呈相同的效應(yīng)。 結(jié)論 本研究證實(shí)在體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下，多廿醇對(duì)HepG2細(xì)