3-羥基丙酸循化特征酶-丙二酸單酰輔酶A還原酶的表達、純化與結晶.pdf

1、3-羥基丙酸途徑是近些年發(fā)現(xiàn)的一種新型的CO2固定方式，首先在一種嗜熱絲狀不產氧光合細菌（Filamentous anoxygenic phototroph簡稱FAPs）中被發(fā)現(xiàn)。本論文的實驗材料Roseiflexus castenholzii中文名稱光合玫瑰彎菌，是FAPs中最新發(fā)現(xiàn)的一種。3-羥基丙酸循環(huán)的特征代謝中間產物是3-羥基丙酸，此化合物可用于合成許多重要的化工產品，被認為是最具開發(fā)潛力的化工產品之一。這一循環(huán)式固碳方式中涉

2、及幾種多功能酶，其中就包括催化形成3-羥基丙酸的丙二酸單酰輔酶A還原酶(MCR)。目前已知這種酶不涉及其他的生物代謝過程，因而可以作為3-羥基丙酸循環(huán)的特征酶。對丙二酸單酰輔酶A還原酶的結構和功能的研究不僅有助于我們揭示3-羥基丙酸的形成過程，深入對3-羥基丙酸循環(huán)固碳途徑的理解，同時也促進人們對多功能酶催化機制的認識。
　　本論文采用分子生物學和蛋白質化學方法對丙二酸單酰輔酶A還原酶展開了如下實驗:(1)以Roseiflexus

3、 castenholzii基因組為模板，根據(jù)JGI數(shù)據(jù)庫中的丙二酸單酰輔酶A還原酶的基因序列設計特異性引物，PCR擴增目的片段后，將目的片段重組到表達載體pEASY-E1上，然后轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行異源表達;(2)通過預處理、親和層析、離子交換、凝膠過濾等方法對目的蛋白MCR進行分離純化，純化獲得的蛋白質用抗His抗體進行Western Blot鑒定;(3)制作MCR的兔源多克隆抗體，并用兔多抗進行WesternBlo