缺氧微環(huán)境中Bcl-2干擾對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Ec9706血管生成擬態(tài)的影響.pdf

1、研究背景及目的:
　　食管癌是常見的消化道腫瘤，發(fā)病率及死亡率均很高。早期食管癌可無癥狀或僅有胸骨后不適、燒灼感、間歇性吞咽困難、異物感等極輕微癥狀，多無法引起患者及家屬的重視而及時(shí)就診，故大多數(shù)患者就診時(shí)已屬于臨床中晚期，臨床療效差，預(yù)后差。惡性腫瘤的進(jìn)展快，預(yù)后差，與腫瘤的血液供應(yīng)密切相關(guān)。
　　腫瘤內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)主要作用包括兩方面，首先保證腫瘤細(xì)胞的氧供、營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的排泄以此來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);另外其管壁結(jié)構(gòu)不完整，

2、基底膜厚薄不一，這就為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入管腔從而發(fā)生血道轉(zhuǎn)提供了便利條件。以往人們對(duì)腫瘤的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究主要集中在內(nèi)皮依賴性血管生成上，自Maniotis首次在高侵襲性葡萄膜黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)樣血管結(jié)構(gòu)(Vasculogenicmimicry，VM)后，相繼在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腎透明細(xì)胞癌、食管癌等腫瘤均發(fā)現(xiàn)有存在VM現(xiàn)象，并證實(shí)VM形成與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、不良預(yù)后明顯正相關(guān)。VM指的是高侵襲性腫瘤細(xì)胞模仿胚胎血管網(wǎng)絡(luò)模式的能力，其獨(dú)

3、立于內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管，是由腫瘤細(xì)胞參與構(gòu)成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀血管，血液在管腔內(nèi)流動(dòng)，并與宿主血管相通，能為腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移提供良好的血液灌注。已有研究表明缺氧能促進(jìn)食管癌VM形成，但其確切的機(jī)制尚不清楚，Bcl-2介導(dǎo)的VE-cad過表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌VM形成。但在食管癌細(xì)胞VM的形成中是否以同樣的機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Cocl2化學(xué)法誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞系Ec9706形成缺氧微環(huán)境;
　　2.在缺氧

4、微環(huán)境中以Bcl-2-siRNA干擾人食管鱗癌細(xì)胞系Ec9706;
　　3.利用三維培養(yǎng)體系模擬人體內(nèi)環(huán)境，以此來培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞Ec9706，并置于熒光倒置顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組（常氧對(duì)照組，缺氧對(duì)照組，缺氧空載體組，缺氧實(shí)驗(yàn)組）管道結(jié)構(gòu)形成形態(tài)及數(shù)量;
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)干擾前后各實(shí)驗(yàn)組（常氧對(duì)照組，缺氧對(duì)照組，缺氧空載體組，缺氧實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞的增殖情況;
　　5.采用RT-PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組(常氧對(duì)照組，

5、缺氧對(duì)照組，缺氧空載體組，缺氧實(shí)驗(yàn)組)VM相關(guān)分子Bcl-2，VE-cadherin及MMP2的mRNA表達(dá)情況;
　　6.采用Westernblot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組(常氧對(duì)照組，缺氧對(duì)照組，缺氧空載體組，缺氧實(shí)驗(yàn)組)VM相關(guān)分子Bcl-2，VE-cadherin及MMP2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.三維培養(yǎng)體系觀察各實(shí)驗(yàn)組管狀結(jié)構(gòu)形成數(shù)量:缺氧對(duì)照組比常氧對(duì)照組形成更多的網(wǎng)絡(luò)樣管狀結(jié)構(gòu)(P＜0.000);而在

6、缺氧下進(jìn)行Bcl-2-siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)組網(wǎng)絡(luò)樣管腔結(jié)構(gòu)比缺氧對(duì)照組和空載體組顯著減少(P＜0.000);而缺氧對(duì)照組和空載體組直接沒有顯著差異（P=0.051）;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況:常氧對(duì)照組，缺氧對(duì)照組，缺氧空載體組，缺氧實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為6.17±0.17、0.6±0.12、1.2±0.12、22.63±0.37，缺氧對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯低于于常氧對(duì)照組(P＜0.05)，缺氧實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率

7、顯著強(qiáng)于缺氧對(duì)照組(P＜0.05);
　　3.PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組VM相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況:缺氧對(duì)照組Bcl-2，VE-cadherin的mRNA表達(dá)情況均明顯高于常氧對(duì)照組(P＜0.05)，缺氧實(shí)驗(yàn)組Bcl-2，VE-cadherin，MMP2的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。缺氧對(duì)照組和缺氧空載體組之間無顯著差異(P＞0.05);
　　4.Western-blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組VM相關(guān)分子蛋白表達(dá)情況:缺氧對(duì)照組Bcl

8、-2，VE-cadherin的蛋白表達(dá)情況均明顯高于常氧對(duì)照組（P＜0.05），缺氧實(shí)驗(yàn)組Bcl-2，VE-cadherin，MMP2的表達(dá)較缺氧對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，缺氧對(duì)照組和缺氧空載體組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞Ec9706血管生成擬態(tài)的形成。
　　2.在缺氧微環(huán)境中進(jìn)行Bcl-2-siRNA干擾食管鱗癌細(xì)胞Ec9706后，VM相關(guān)的分子VE-cad