人VEGF-,165-轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、研究背景：外傷或先天性小耳畸形致耳廓缺損患者在整形外科十分常見，而耳廓軟骨幾乎無再生修復(fù)能力，目前臨床上主要的治療方法為全耳廓再造術(shù)，對手術(shù)醫(yī)師技術(shù)要求較高，且存在不同程度的并發(fā)癥，如采集自體肋軟骨雕刻耳支架可致胸廓畸形，而支架可能感染、吸收、變形。人工高分子耳支架植入容易引發(fā)機(jī)體排異反應(yīng)致使支架外露發(fā)生率較高。因此，自體軟骨細(xì)胞組織工程研究應(yīng)運(yùn)而生。盡管已有自體軟骨細(xì)胞組織工程軟骨批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用，但僅能修復(fù)體積小于1ml缺損。

2、 研究發(fā)現(xiàn)組織工程軟骨厚度超過1mm，中心易發(fā)生“空心”現(xiàn)象。而這種“空心”現(xiàn)象的主要原因在于軟骨組織缺乏血管，細(xì)胞代謝依賴細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的滲透，隨著外層細(xì)胞外基質(zhì)不斷的合成與成熟，超過一定厚度的內(nèi)層細(xì)胞因傳導(dǎo)效率降低，發(fā)生代謝障礙致組織缺氧和壞死。因此，保持內(nèi)層細(xì)胞增殖、存活，并維持軟骨細(xì)胞生物特性成為本實驗研究的焦點(diǎn)。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia

3、l growth factor，VEGF)，是體內(nèi)重要的促血管生長因子。對成熟軟骨細(xì)胞分泌表達(dá)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞表達(dá)一定水平的VEGF以提高軟骨細(xì)胞有絲分裂活性并促進(jìn)其再分化，在軟骨發(fā)生發(fā)育過程中，對軟骨細(xì)胞的存活與增殖起著重要的作用[7]。運(yùn)用基因工程技術(shù)，將VEGF基因?qū)胲浌羌?xì)胞，構(gòu)建VEGF強(qiáng)化組織工程軟骨，將有利于軟骨細(xì)胞存活、增殖、分化，改善組織工程軟骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 目的：觀察檢測殘耳軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增生物學(xué)性能。

4、構(gòu)建hVEGF165基因載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的殘耳軟骨細(xì)胞，通過檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞VEGF及主要軟骨ECM蛋白表達(dá)，以分析轉(zhuǎn)VEGF基因軟骨細(xì)胞的生物性能，并對轉(zhuǎn)VEGF基因軟骨細(xì)胞體內(nèi)構(gòu)建的軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)、ECM蛋白及相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測分析。 方法： 1.構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒rAAV2—hVEGF165—CMV—EGFP載體。 2.分離、培養(yǎng)人殘耳軟骨細(xì)胞，檢測倍增時間，免疫組化，RT-PCR方法檢測其產(chǎn)生軟骨EC

5、M主要成分能力，包括蛋白聚糖(aggrecan，AG)，Ⅰ型膠原(collagentypeⅠ，COLⅠ)，Ⅱ型膠原(collagentypeⅡ，COLⅡ)，Ⅹ型膠原(collagentypeⅩ，COLⅩ)。 3.rAAV2—hVEGF165—CMV—EGFP轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，組織學(xué)染色、免疫組化、Real-TimePCR、WesternBlot、ELISA檢測VEGF表達(dá)規(guī)律及轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)的變

6、化。 4.轉(zhuǎn)染rAAV2—hVEGF165—CMV—EGFP的軟骨細(xì)胞與PluronicF—127混合，形成細(xì)胞材料復(fù)合物接種于裸鼠皮下，同時分別設(shè)立轉(zhuǎn)染rAAV2—EGFP細(xì)胞組及單純軟骨細(xì)胞組為對照組，10周后取材，組織學(xué)染色、免疫組化比較觀察三組軟骨組織結(jié)構(gòu)，Real-TimePCR、WesternBlot等方法檢測其ECM蛋白及與軟骨細(xì)胞增殖存活相關(guān)基因表達(dá)。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建rAAV2—hVEGF1

7、65—CMV—EGFP載體。 2.殘耳軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中，逐漸由多角形變?yōu)殚L梭形，AG、COLⅡ、COLⅩ逐漸減少，第5代時COLⅡ、COLⅩ表達(dá)消失，并開始表達(dá)COLⅠ。 3.rAAV2—hVEGF165—CMV—EGFP載體體外成功轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染第3天轉(zhuǎn)染效率達(dá)20.1±0.62％，并維持穩(wěn)定。轉(zhuǎn)染后VEGF表達(dá)延遲期為14—21天，隨VEGF表達(dá)增高，軟骨細(xì)胞AG、COLⅡ、COLⅩ及COLⅠ表達(dá)顯著增高

8、。 4.三組細(xì)胞—材料復(fù)合物接種裸鼠皮下10周后取材，均形成大小不一的軟骨，組織切片染色見VEGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞實驗組形成均一軟骨組織，軟骨細(xì)胞及軟骨陷窩分布均勻，糖胺多糖及膠原纖維含量豐富，彈性纖維呈網(wǎng)狀分布均勻，而兩個對照組軟骨組織間見局部空泡樣結(jié)構(gòu)，糖胺多糖、膠原纖維含量欠佳，彈性纖維成條索樣分割包繞軟骨細(xì)胞。免疫組化結(jié)果見三組樣本均有VEGF陽性細(xì)胞，實驗組分布于軟骨組織邊緣，對照組散在于組織中，三組Ⅷ因子表達(dá)均為陰性。Wes

9、ternBlot結(jié)果見實驗組VEGF、COLⅡ表達(dá)強(qiáng)于對照組，VEGFR—2僅在實驗組表達(dá)。GAG含量檢測實驗組顯著增高，對照組間無明顯差異。Real-TimePCR結(jié)果顯示，實驗組較對照組的RunX2、Sox9表達(dá)增高，PTH/PTHrR無顯著性變化，同時COLⅩ及COLⅡ表達(dá)增高，而對照組間RunX2等的表達(dá)無明顯差異。 結(jié)論： 1.rAAV2—hVEGF165—CMV—EGFP能體外轉(zhuǎn)染人殘耳軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染第3天轉(zhuǎn)

10、染效率達(dá)20.1±0.62％，并維持穩(wěn)定。 2.轉(zhuǎn)染后，VEGF表達(dá)提高了軟骨細(xì)胞功能而具備良好的生物學(xué)特性。轉(zhuǎn)染14天的第3代軟骨細(xì)胞ECM主要蛋白表達(dá)增高，細(xì)胞功能活躍，適宜做為組織工程軟骨種子細(xì)胞。 3.轉(zhuǎn)VEGF基因軟骨細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞與pluronicF—127復(fù)合后可于裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨，與對照組相比，轉(zhuǎn)VEGF基因組織工程軟骨具良好的生物學(xué)特性，結(jié)構(gòu)均一且與正常軟骨組織相似，軟骨ECM