超順磁性殼聚糖明膠微球載BMP-,9-和VEGF-,165-基因促進(jìn)骨缺損愈合的初步研究.pdf

1、目的：觀察振蕩磁場(chǎng)和/或靜磁場(chǎng)下超順磁性殼聚糖明膠微球載VEGF165和/或BMP9基因?qū)Υ龠M(jìn)生物活性人工骨血管化和骨缺損愈合的作用。 方法：（1）制備大量能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)人BMP9和人VEGF165的質(zhì)粒。分別用PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ雙酶切后，行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度。（2）用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性殼聚糖納米微球

2、（SPFCN），掃描電鏡和振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)等儀器對(duì)合成的SPFCN進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)構(gòu)表征。（3）用交聯(lián)固化法制備超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球（SPCPGM）。（4）用納米羥基磷灰石/聚酰胺骨水泥（四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供）制備中空帶側(cè)孔的仿兔橈骨中段骨缺損修復(fù)支架，將一定量的兩種超順磁性殼聚糖質(zhì)粒明膠微球分別填入中空支架中。（5）選用新西蘭兔48只，建立兔橈骨雙側(cè)骨缺損模型，隨機(jī)分為（A組）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+

3、振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；（B組）SPCPGM（BMPg+VEGF165）+靜磁場(chǎng)；（C組）SPCPGM（VEGF165）+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；（D組）SPCPGM（VEGF165）+靜磁場(chǎng)。術(shù)后2周、4周、8周、12周，搜集標(biāo)本，通過大體觀察，X線檢測(cè)，組織切片光學(xué)顯微鏡觀察，求積儀測(cè)量和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析等方法對(duì)生物活性人工骨血管化和成骨情況進(jìn)行定性及定量測(cè)定，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)估四種不同處理組成骨的情況。 結(jié)果：（

4、1）兩種質(zhì)粒（pAdTRACKBMP9.pDsVEGF165）經(jīng)擴(kuò)增、純化后，PvuⅡ、SalⅠ和SacⅡ、HandⅢ雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定顯示：BMPg片段大?。?290bp），VEGF165片段大?。?73bp）與預(yù)期相符；基因序列測(cè)定結(jié)果表明，基因序列正確。用SmartSpecTM3000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)BMPg質(zhì)粒濃度為0.49±0.09mg/ml；VEGF165質(zhì)粒濃度為0.37±0.06mg/ml。（2）掃描電鏡下F

5、e3O4納米粒外形呈橢圓形或圓形，均勻度好，粒徑為23；3.47nm。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)顯示制備的超順磁納米微球具有超順磁性。（3）制備SPCPGM時(shí)，SPFCN與pAdTRACKBMP質(zhì)粒和pDsVEGF165質(zhì)粒結(jié)合時(shí)的最適氮/磷（N/P）比例為2.5/1。（4）磁場(chǎng)（振動(dòng)磁場(chǎng)和/或靜磁場(chǎng)）下SPCPGM促進(jìn)人工骨成骨的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明：①SPCPGM（BMP9+VEGF165）促進(jìn)生物活性人工骨血管化和成骨作用效果，優(yōu)于單獨(dú)使用S

6、PCPGM（VEGF165）。②靜磁場(chǎng)和振動(dòng)磁場(chǎng)聯(lián)合應(yīng)用，能夠明顯提高SPCPGM體內(nèi)局部成骨作用，4周時(shí)已有大量成骨。③促進(jìn)成骨的作用的順序：1）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；2）SPCPGM（VEGF165）+振蕩磁場(chǎng)+靜磁場(chǎng)；3）SPCPGM（BMP9+VEGF165）+靜磁場(chǎng)≈4）SPCPGM（VEGF165）+靜磁場(chǎng)。④振動(dòng)磁場(chǎng)的應(yīng)用，能夠促使局部磁性微球殘留量的明顯減少。 結(jié)論：超順磁性