VEGF-,165-對無細(xì)胞真皮基質(zhì)血管化影響的研究.pdf

1、目的：觀察SDS和NaOH復(fù)合消蝕法制備的胎兒無細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellulardermalmatrix,ADM)的組織相容性，以及VEGF165對ADM的血管化的影響。為進(jìn)一步改良真皮支架提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用足月胎兒皮膚，將皮膚切成4×5cm，經(jīng)1M高滲NaCl溶液浸泡24小時，除去表皮，再先后用0.5％SDS和4％NaOH溶液各消蝕10個小時，其間用超聲波清洗儀間斷振蕩以除去細(xì)胞碎片，制成ADM。取ADM，常規(guī)脫水，石

2、蠟包埋及切片，HE染色，觀察ADM的一般結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分的殘留情況。取2×2cm制備好的ADM，用冰凍切片機(jī)將其制成厚約為300μm放入溶有青霉素的PBS中4℃保存待用。選用重約300克的SD雄性大鼠45只，隨機(jī)分為ADM包埋組、ADM加rAAV/LacZ組和ADM加rAAV/VEGF165組，每組15只。采用背部切口，切口大小為2.5×2.5cm。分別將ADM或ADM+rAAV/LacZ或ADM+rAAV/VEGF165包埋于真皮和皮肌

3、之間，然后縫合、包扎。術(shù)后2，4，6周分別取材，每組5只。所取標(biāo)本用Bouin液固定，脫水，包埋，切片后作如下處理：1.HE染色；2.以VEGF165，MMP-1，TIMP-1的單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測三種蛋白質(zhì)在移植后的皮膚中的表達(dá)情況。觀察并比較各組中ADM血管密度。進(jìn)行圖象處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過以上的觀察分析，比較不同組之間血管化情況和愈合情況。 結(jié)果：1.經(jīng)SDS和NaOH各10小時消蝕后的ADM從外觀和物理

4、性能上看，韌性較好，同時質(zhì)地較柔軟，具有一定的抗張力作用。經(jīng)組織切片HE染色后發(fā)現(xiàn)，此時ADM組織中無細(xì)胞成分，其結(jié)構(gòu)主要為嗜酸性的膠原成分。2.ADM皮下包埋實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組的大鼠在術(shù)后傷口均未見不良反應(yīng)，愈合良好，縫口處有輕微的瘢痕形成，取材時觀察，包埋于皮下的ADM與真皮已愈著。3.術(shù)后2周觀察包埋ADM組織中有少量的細(xì)胞成分出現(xiàn)，可見到早期新生毛細(xì)血管，及VEGF陽性細(xì)胞。此時ADM臨近組織中MMP-1和TIMP-1均明顯表達(dá)，而且

5、MMP-1高于TIMP-1，顯示ADM血管化已開始，MMP-1與ADM血管化進(jìn)程相關(guān)。4.術(shù)后4周，ADM空白組和rAAV/LacZ對照組的ADM中，細(xì)胞數(shù)量和新生血管均高于2周。此時各組中ADM及臨近組織中MMP-1的表達(dá)高于TIMP-1，但TIMP-1的表達(dá)較2周時有所增強(qiáng)。提示此時血管化過程中細(xì)胞遷移相對降低，新生血管的再塑有所加強(qiáng)。5.術(shù)后6周，各組ADM中的細(xì)胞數(shù)、新生血管的密度與4周時相比無明顯變化。rAAV/VEGF165

6、實(shí)驗(yàn)組中VEGF陽性細(xì)胞和血管密度明顯高于ADM空白組和rAAV/LacZ對照組(P＜0.05)，提示實(shí)驗(yàn)組中外源性VEGF已導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并開始表達(dá)并發(fā)揮生物學(xué)作用。而載體(rAAV/LacZ)本身對ADM的血管化無明顯影響。此時TIMP-1的表達(dá)則高于MMP-1，預(yù)示ADM中新生血管的再塑加強(qiáng)及趨向成熟。 結(jié)論：1.SDS和NaOH復(fù)合消蝕法所制成的ADM去除細(xì)胞徹底，并保持了真皮中原有細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)筑的形態(tài)學(xué)完整，而且免疫原