大豆再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組分析及GmARF2基因的初步研究.pdf

1、近年來國內(nèi)大豆進口量連年增長，這將會對我國的大豆產(chǎn)業(yè)及糧食安全造成嚴重的威脅。要盡早擺脫國內(nèi)大豆依賴進口的狀態(tài)，除了應(yīng)用傳統(tǒng)育種的方式外，還應(yīng)加快分子育種的步伐，充分利用和挖掘我國大豆原產(chǎn)地豐富的種質(zhì)資源，努力爭取在短期內(nèi)提升國內(nèi)大豆的單產(chǎn)和總產(chǎn)水平。與水稻、煙草等作物相比，大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率低下，目前已嚴重阻礙大豆分子育種和大豆基因功能的研究。要利用分子育種提高大豆產(chǎn)量，就必須優(yōu)先解決大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率低下這一世界難題。能夠獲得高效、穩(wěn)

2、定的大豆再生體系，并將其應(yīng)用在生物技術(shù)育種中，就可以提高大豆育種的速率。要建立高效穩(wěn)定的大豆再生體系首先應(yīng)明確與大豆再生相關(guān)的關(guān)鍵基因的功能及其作用機理，才能建立高效穩(wěn)定的大豆再生體系，進而將生物技術(shù)應(yīng)用到大豆育種中，最終提高大豆產(chǎn)量。
　　隨著現(xiàn)代分子生物學、生物信息學、基因工程等前沿學科迅猛發(fā)展，為挖掘功能顯著的基因和轉(zhuǎn)基因分子育種提供了高效、科學的技術(shù)手段，也是當今世界發(fā)達國家和發(fā)展中國家的優(yōu)先發(fā)展戰(zhàn)略和搶占的科技制高點。轉(zhuǎn)

3、錄組測序技術(shù)是近年來炙手可熱的研究方法，轉(zhuǎn)錄組學是從宏觀水平上研究細胞中基因表達情況及調(diào)控規(guī)律的學科。轉(zhuǎn)錄組學是功能基因組學的一個重要方面，能夠研究某一功能狀態(tài)下細胞、組織和器官中所有表達水平。轉(zhuǎn)錄組學是一種以宏觀角度進行整體研究的方法，改變了以往選定單個基因或少數(shù)幾個基因進行片面研究的模式，將功能基因組學研究帶入了一個全新的快速發(fā)展的新時期。
　　本研究選用東北大豆品種東農(nóng)50和綏農(nóng)14，首先對下胚軸在組織培養(yǎng)過程中受外源激素2

4、，4-D影響過程的生理生化及形態(tài)指標進行分析，得到與該品種大豆再生相關(guān)的關(guān)鍵時期。隨后將篩選到的材料進行轉(zhuǎn)錄組測序，對測序結(jié)果進行分析得到與大豆再生關(guān)鍵時期相關(guān)的生物信息數(shù)據(jù)，并篩選出與大豆再生直接相關(guān)的差異表達基因。選擇其中一個重要基因GmARF2進行克隆及生物信息學分析，構(gòu)建了該基因的植物表達載體，并對大豆和擬南芥進行了遺傳轉(zhuǎn)化。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)大豆再生率是大豆遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素，東農(nóng)50和綏農(nóng)14兩

5、個品種在外源2，4-D濃度為4mg/L時，其再生率明顯高于對照，而該濃度也與兩個大豆品種內(nèi)源激素與酶活性表達峰值所處的2，4-D濃度相對應(yīng)，說明該濃度2，4-D對大豆再生起到了最佳促進作用。
　　(2)通過以上材料進行的轉(zhuǎn)錄組測序共得到24.0Gb數(shù)據(jù)，測序結(jié)果優(yōu)良，得到了一個關(guān)于大豆再生相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫。其中，GO數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果顯示，代謝相關(guān)、發(fā)育進程、催化活性的基因被顯著富集。通過Pathway散點圖的結(jié)果顯示，定位在丙氨酸

6、、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、碳代謝、生物固氮等途徑的基因較多。數(shù)據(jù)庫累計獲得上調(diào)差異表達基因149個，下調(diào)表達基因72個，其中與再生直接相關(guān)的基因共有9個。
　　(3)將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選出與大豆再生相關(guān)的差異表達基因(登錄號:Glyma13g29320)，在Phytozome中與擬南芥、苜蓿等作物進行比對，將其命名為GmARF2。利用生物信息學的分析方法對GmARF2核苷酸序列啟動子元件及編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)、親

7、水性、進化樹等生物信息分析，并對該基因在大豆品種東農(nóng)50中進行了組織特異性分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谏L素響應(yīng)因子家族，能夠調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達。它能夠結(jié)合生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域內(nèi)的生長素響應(yīng)元件，使下游基因的表達受到促進或抑制，進而影響大豆再生過程。
　　(4)對GmARF2基因克隆，進行植物表達載體的構(gòu)建，得到GmARF2-pCAMBIA3301植物表達載體。
　　(5)對GmARF2基因進行遺傳轉(zhuǎn)化，得到了擬南芥和大豆