幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨再生相關基因cDNA差示文庫構(gòu)建及部分相關基因分析.pdf

1、研究背景：關節(jié)軟骨損傷后的修復一直是醫(yī)學界面臨的難題之一，關節(jié)軟骨損傷后不能得到良好修復及功能恢復的關鍵問題在于：目前尚無有效的方法使損傷部位形成永久性的透明軟骨關節(jié)面。根據(jù)文獻報道，軟骨細胞在特定的環(huán)境下可以去分化為成軟骨細胞，因此，尋找軟骨細胞去分化的激活因子和誘導機制成為解決關節(jié)軟骨損傷后自然修復的關鍵問題。據(jù)國外文獻報道，幼年新西蘭白兔關節(jié)軟骨損傷后修復關節(jié)面中透明軟骨含量達80％以上，修復組織的結(jié)構(gòu)和耐久度均接近正常關節(jié)軟骨，

2、而成年新西蘭白兔關節(jié)軟骨損傷后只有少量纖維軟骨組織修復。推測在幼年和成年動物關節(jié)軟骨損傷后的修復過程中，存在修復相關基因表達的差異導致修復結(jié)果不同。研究具有明確軟骨再生修復能力的動物模型損傷軟骨局部早期的基因表達，有可能發(fā)現(xiàn)軟骨再生修復的關鍵基因，并進一步研究其修復機制，具有重要的理論意義和應用價值。 目的：利用抑制性消減雜交技術研究幼年新西蘭白兔膝關節(jié)軟骨損傷后差異表達基因，構(gòu)建幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨的差減基因片斷文庫，篩

3、選克隆主導幼年新西蘭白兔膝關節(jié)軟骨損傷后自然修復的相關基因，為后續(xù)課題研究奠定基礎和研究平臺。 方法：采用一步法和PlantRNAout相結(jié)合的方法提取損傷關節(jié)軟骨組織總RNA，采用SMART與SSH相結(jié)合的方法，分離幼年新西蘭白兔損傷膝關節(jié)軟骨修復過程中差異表達基因。具有親子關系的50周齡成年新西蘭雌性白兔及其子代8周齡幼年新西蘭白兔(雌雄不限)共3對。用直徑3mm鉆頭在膝關節(jié)股骨關節(jié)面背側(cè)造成直徑3mm深3mm的關節(jié)軟骨組織

4、及軟骨下骨的缺損，取損傷后4周損傷部位關節(jié)軟骨修復組織作為實驗標本。幼年新西蘭白兔的修復組織為Tester組，即檢測子；成年親代雌性新西蘭白兔的修復組織為Driver組，即驅(qū)動子。用RsaⅠ酶使cDNA切割成為具有平頭末端的小片段后，將Tester分為兩份并分別在其平頭末端連上不同的接頭Adaptor1或Adaptor2R，與酶切后的Driver進行兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR擴增，富集差異表達基因，并將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體

5、進行T/A連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍白斑實驗初步篩選，挑選陽性克隆，陽性克隆菌擴增后建立消減cDNA文庫，PCR驗證陽性克隆插入片斷，并送上海生物工程公司測序。測序結(jié)果通過Chromas軟件去除載體序列及插入片斷兩端的接頭序列得到EST片斷，用DNAStar5.01對EST片斷進行分析，去除冗余的重復序列得到差顯基因片斷，并在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，反向Northern斑點雜交驗證差顯基因表達情況，

6、對差異表達基因進行分析，選擇有意義的目的基因片斷進行后續(xù)全長基因克隆和功能研究。 結(jié)果：用一步法結(jié)合plantRNAout法提取的總RNA純度高、完整性和穩(wěn)定性好，成功逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。用SMART與SSH相結(jié)合的方法成功地構(gòu)建了幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨修復過程中差異表達cDNA文庫。藍白斑實驗獲得223個陽性克隆菌落，隨機選擇64個克隆進行PCR驗證，90％克隆均有插入片斷。共送217個陽性克隆測序，成功測序199個。

7、測序后分析得到20個差異表達基因片斷，其中1個為單引物擴增序列，通過同源性檢索鑒定了13個(其中包括1個載體序列和6個無意義基因，分屬于線粒體基因、核糖體基因、表達載體基因和管家基因等)，發(fā)現(xiàn)6個未報道基因片斷。反向Northern斑點雜交證明，20個差異表達基因片斷中有18個在幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨組織表達，2個假陽性差顯片斷被排除。幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨與其親代雌兔比較，特異性表達的基因有3個，均為未報道基因序列，9個基因表

8、達上調(diào)，其中包括3個未報道基因片斷。差顯基因片斷均在GeneBank登錄并獲得注冊。 結(jié)論： 1、一步法結(jié)合plantRNAout的總RNA提取方法，簡便、快速、經(jīng)濟，適合富含多糖的關節(jié)軟骨組織小量高質(zhì)量的總RNA提取。 2、用SMART和SSH相結(jié)合的辦法成功的構(gòu)建了含有199個克隆的幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨修復組織cDNA差異表達基因文庫。 3、分析文庫中的基因，發(fā)現(xiàn)幼年新西蘭白兔關節(jié)軟骨損傷后4周

9、，基因表達較成年兔明顯活躍，差異表達基因包括鈣離子結(jié)合蛋白、皮質(zhì)穩(wěn)定素4、Ⅰ型膠原α2鏈、Ⅺ型膠原α1鏈等。部分基因與軟骨細胞的新陳代謝和細胞外基質(zhì)的合成密切相關。 4、發(fā)現(xiàn)了6個未報道EST序列，在GenBank中成功注冊。 5、反向Northen斑點雜交提示有3個差顯EST片斷在幼年新西蘭白兔損傷關節(jié)軟骨特異性表達，而成年新西蘭白兔不表達，此部分基因很有可能是主導幼年新西蘭白兔關節(jié)軟骨修復的相關因子，進一步研究這3條