EGS文庫構(gòu)建與反向遺傳篩選的研究.pdf

1、核酸酶P(RNaseP)是一種核蛋白復(fù)合物，它主要識別和切割前體tRNA的前導(dǎo)序列以產(chǎn)生成熟形式的tRNA。RNaseP具有兩個獨特的特性：它是所有生物體內(nèi)含量最多、最穩(wěn)定、最有效的核酸酶：它的誘導(dǎo)反應(yīng)機(jī)制取決于對靶標(biāo)RNA高級結(jié)構(gòu)的識別，而不是依賴于對靶標(biāo)RNA一級結(jié)構(gòu)的識別。由兩個核酸分子組成并具有類tRNA結(jié)構(gòu)的復(fù)合物可被RNaseP特異地識別和切割，該復(fù)合物中的其中一個小分子RNA被稱為EGS(ExternalGuideSequ

2、ence，外指引序列)。EGS誘導(dǎo)RNaseP對其靶標(biāo)RNA進(jìn)行識別和切割，但不會導(dǎo)致非靶標(biāo)RNA被降解。EGS的靶標(biāo)特異性由以下兩種分子間相互作用所決定：EGS的靶標(biāo)配對區(qū)域與靶標(biāo)RNA中的靶標(biāo)區(qū)域的堿基互補作用；靶標(biāo)RNA與EGS的類tRNA結(jié)構(gòu)(相當(dāng)于tRNA中的“T-stem”、“T-loop”和“VailiableRegions”結(jié)構(gòu))的相互作用?！?/4EGS”衍生于大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)運RNA(tRNATyr)，其效能已被大

3、量的實驗結(jié)果所驗證?！?/4EGS”由靶標(biāo)配對序列(與靶標(biāo)RNA的靶標(biāo)序列互補配對)和RNaseP識別序列(部分天然tRNA序列)所組成。 基于RNA文庫的反向遺傳篩選、突變篩選以及基因敲除等研究使1500多個秀麗隱桿線蟲基因與表型建立聯(lián)系。但秀麗隱桿線蟲基因組中20000多個預(yù)測基因中大部分基因的功能有待研究。不同研究者利用RNAi文庫對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行反向遺傳篩選所獲取的結(jié)果存在較大差異。即使同一研究者采用同樣的實驗步驟，各

4、次實驗間的RNAi篩選結(jié)果仍有10％～30％的變異性。這要求建立新的反向遺傳篩選工具以推動秀麗隱桿線蟲的反向遺傳篩選。 本文在驗證EGS技術(shù)可用于干擾秀麗隱桿線蟲的基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，設(shè)計和構(gòu)建了EGS文庫，并驗證其對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行了反向遺傳篩選的有效性。 秀麗隱桿線蟲的綠色熒光蛋白(gfp)轉(zhuǎn)基因株(PD4251)中具有兩種綠色熒光蛋白，一種是具有核定位信號的綠色熒光蛋白(Ngfp)--由Ngfp-lacZmRNA編碼

5、，另外一種是具有線粒體定位信號的綠色熒光蛋白(Mtgfp)--由MtgfpmRNA編碼。 本文選擇Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA作為EGS的靶標(biāo)mRNA，以驗證EGS技術(shù)用于干擾秀麗隱桿線蟲基因表達(dá)的可行性。在RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件的輔助下，以“3/4EGS”為設(shè)計框架設(shè)計了靶向Ngfp-lacZmRNA的EGS-Ngfp-lacZ和靶向MtgfpmRNA的EGS-Mtgfp。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-

6、Mtgfp的表達(dá)框被分別克隆至pET28a表達(dá)載體以構(gòu)建pET28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp。pET28a-EGS-Ngfp-lacZ為含有EGS-Ngfp-lacZ表達(dá)框的重組載體，其EGS-Ngfp-lacZ表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動子的控制下；pET28a-EGS-Mtgfp為含有EGS-Mtgfp表達(dá)框的重組載體，其EGS-Mtgfp表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動子的控制下。分別以pET

7、28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp為模板，PCR擴(kuò)增EGS-Ngfp-lacZ-IVTT和EGS-Mtgfp-IVTT，以分別作為EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp的體外轉(zhuǎn)錄模板。利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，對EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp進(jìn)行制備。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp被單獨或共同導(dǎo)入PD4251中。以“SoakingBuffer”處理的PD4251作為對照，

8、EGS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp單獨處理的PD4251的熒光強(qiáng)度有所下降，但EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp共同處理的PD4251的熒光強(qiáng)度明顯下降。為了驗證熒光強(qiáng)度的下降是由上述EGS誘導(dǎo)RNaseP對其相應(yīng)靶標(biāo)RNA進(jìn)行識別和切割所導(dǎo)致的，利用熒光實時定量PCR技術(shù)(QPCR)對GFPmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析；GFPmRNA的表達(dá)水平是Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA的表達(dá)水平的代表。與“

9、SoakingBuffer”處理的PD4251的GFPmRNA的表達(dá)水平相比，EOS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp處理的PD4251的GFPmRNA表達(dá)水平分別下降了32±4.3％和37±5.2％。EGS-Ngfp-lacZ和EGS±Mtgfp共同處理的PD4251的GFPmRNA表達(dá)水平下降了93±3.6％。為了進(jìn)一步驗證EGS-Ngfp-1acZ和EGS-Mtgfp對其靶標(biāo)的干擾效力，利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernbl

10、ot)分析了Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平。與“SoakingBuffer”處理的PD4251的Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平相比，EGS-Ngfp-lacZ處理的PD4251的Ngfp蛋白的表達(dá)水平降低了54±5.1％，但Mtgfp蛋白的表達(dá)水平僅降低了4±6.3％。EGS-Mtgfp處理的PD4251的Mtgfp蛋白的表達(dá)水平降低了64±3.8％，但Ngfp蛋白的表達(dá)水平僅降低了6±3.3％。EGS-Ngfp-lae

11、Z和EGS-Mtgfp共同處理的PD4251的Ngfp和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平分別降低了67±5.6％，94±2.8％。 以“3/4EGS”為設(shè)計框架對EGS文庫(LEGS)進(jìn)行設(shè)計。EGS文庫的設(shè)計如下：“3/4EGS”的靶標(biāo)配對區(qū)域由隨機(jī)堿基組成；在“CCA”序列的5’末端添加“UUU”序列以提供EGS的穩(wěn)定性。EGS文庫的表達(dá)框被克隆至pET28a表達(dá)載體以構(gòu)建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS為含有EGS文

12、庫表達(dá)框的重組載體，其EGS文庫表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動子的控制下。把pET28a-LEGS轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中以篩選pET28a-EGS-clone。pET28a-EGS-clone為含有EGS文庫中某一特定表達(dá)框的重組載體，這一表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動子的控制下。為了檢驗EGS文庫的克隆效率及其EGS表達(dá)框的組成是否符合理論設(shè)計，隨機(jī)挑取pET28a-EGS-clone進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析、測序分析及比對分析。

13、 上述分析結(jié)果表明本文構(gòu)建的EGS文庫并不存在傾向性克隆，其EGS表達(dá)框的組成基本滿足理論設(shè)計。 隨機(jī)挑取EGS對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行反向遺傳篩選，以驗證EGS文庫對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行反向遺傳篩選的有效性。以pET28a-EGS-clone為模板，PCR擴(kuò)增EGS的體外轉(zhuǎn)錄模板--EGS-clone-IVTT；以EGS-clone-IVTT為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄對EGS進(jìn)行制備；把EGS導(dǎo)入各齡期的秀麗隱桿線蟲野生株N2中；記錄P0

14、代和F1代的異常表型--不育、子代不育、產(chǎn)卵少、幼蟲生長緩慢、幼蟲滯育、幼蟲死亡、成蟲死亡、形態(tài)異常、肥胖、細(xì)長、麻痹、運動不協(xié)調(diào)。其中約有6％EGS能夠誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲的表型發(fā)生異常變化，如：幼蟲生長緩慢，幼蟲滯育，成蟲死亡，和不育。對能夠誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生異常表型的EGS的靶標(biāo)mRNA進(jìn)行鑒定。通過BLAST分析以及RNAi表型與EGS誘導(dǎo)產(chǎn)生的異常表型的比較分析，EGS-35，EGS-83的靶標(biāo)mRNA被初步鑒定為ZK858.7