黨參SSH與cDNA文庫構(gòu)建.pdf

1、黨參為桔?？浦参稂h參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]、素花黨參CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根。黨參屬植物全世界約有40種，中國約有39種，藥用有21種、4變種。課題組前期AFLP研究發(fā)現(xiàn)，造成黨參質(zhì)量差異的主要原因之一是種群間、種內(nèi)問遺傳變異。即使在同一種植基地，不同種

2、質(zhì)黨參居群問遺傳差異仍然大于居群內(nèi)變異，由此結(jié)構(gòu)基因角度證明種質(zhì)遺傳差異是形成黨參道地性的內(nèi)因。但是，道地黨參種質(zhì)基因表達(dá)規(guī)律及決定黨參道地性的本質(zhì)原因仍未能闡明。因此，尋找新的切入點(diǎn)，探索黨參次生代謝相關(guān)基因在黨參道地性形成中的具體作用，就成為黨參進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。為尋找黨參次生代謝相關(guān)功能基因，本研究采用改良CTAB法提取黨參總RNA，在建立較穩(wěn)定有效的黨參總RNA提取方法的基礎(chǔ)上，利用SSH技術(shù)尋找黨參差異功能基因，并建立了cDN

3、A文庫，通過EST測序，從分子水平上研究黨參種質(zhì)遺傳差異及其道地性形成具體機(jī)制，對(duì)其功能基因進(jìn)行初步探討。
　　 論文主要內(nèi)容如下：
　　 1.黨參葉片總RNA提取方法的建立
　　 以采自海拔1527m的山西陵川GAP種植基地的3年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料。通過對(duì)改良CTAB法、TRIzol試劑盒法和某公司RNA提取試劑盒法對(duì)黨參葉片總RNA提取效果

4、的比較研究，尋找適合黨參葉片組織的有效的總RNA提取方法。結(jié)果表明，改良CTAB法提取的總RNA純度最高，沒有小分子鹽類雜質(zhì)，也沒有蛋白質(zhì)污染；經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析，改良CTAB法提取的黨參總RNA28S與18S條帶的亮度比約為1.5～2.0，基本上無降解，點(diǎn)樣孔無污染，無拖尾現(xiàn)象，表明改良CTAB法是一種提取高質(zhì)量黨參葉片總RNA的有效方法。
　　 2.黨參抑制消減雜交文庫的建立
　　 以采自海拔1529m的山

5、西陵川GAP種植基地的2年生和3年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料，采用建立的改良CTAB法提取總RNA。以2年生黨參葉片提取的總RNA為Tester，以3年生黨參葉片提取的總RNA為Driver進(jìn)行消減雜交。結(jié)果表明，同時(shí)期2年生黨參和3年生黨參間差異基因較少，難以篩選。排除同種同時(shí)期不同年份黨參間選樣方法。
　　 3.黨參cDNA文庫的構(gòu)建
　　 以采自海拔15

6、29m的山西陵川GAP種植基地2年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料，采用建立的改良CTAB法提取總RNA，純化mRNA反轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)RsaI酶切后，分別加上接頭，與pGEM-Teasy載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，建立cDNA文庫。隨機(jī)篩選41個(gè)克隆并測序，對(duì)所得序列進(jìn)行Blastx和Blastn比對(duì)分析，得到40個(gè)Unisequence。其中,30個(gè)序列得到有生物學(xué)意義的顯著相似性的蛋

7、白比對(duì)結(jié)果，16個(gè)有生物學(xué)意義上的高度同源性。所得EST序列中,4個(gè)序列與已知蛋白具有高度同源性，F(xiàn)658、F430、F323、F468和F646分別與類細(xì)胞色素P450(Nicotianatabacum)、L2核糖體蛋白(Anisophylleafallax)、12-氧代植物二烯酸還原酶(Heveabrasiliens)、烯醇酶(Solanumlycopersicum)、過氧化還原酶[Populustrichocarpa]＞gb丨EE