細(xì)胞色素P450基因多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病的相關(guān)研究.pdf

1、研究目的:
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是一種以進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙和記憶能力損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是大腦變性疾病中最常見的疾病，多發(fā)于老年人，發(fā)病率隨年齡的增加而增加。在65歲以上人群中，西方國家約有5％的人罹患此病，85歲以上老年人患病率高達(dá)47％～50％，我國在60歲以上人群中AD的患病率為3％～5％。在發(fā)達(dá)國家，AD已成為繼癌癥、心血管疾病、中風(fēng)之后的第四大死因。我國

2、從20世紀(jì)90年代起，提前進(jìn)入人口老齡化的行列，60歲以上的老人已達(dá)1.26億，占全國人口的10％，并以年均3.3％的速度上升。據(jù)估計到2025年我國60歲以上老年人將達(dá)2.8億，占全國總?cè)丝诘?8.4％，屆時將有1009萬的AD患者。AD的病情呈進(jìn)行性發(fā)展，但由于目前尚無特效的治療藥物或方法，患者通常在確診后的3-9年內(nèi)不治身亡。隨著我國社會老齡化的日趨明顯以及人均壽命的不斷提高，AD對人類生命健康的威脅日益突出。
　　 AD

3、的病理學(xué)特征包括，大腦神經(jīng)細(xì)胞外大量β-淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉積形成的老年斑、皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、皮質(zhì)細(xì)胞減少、血管淀粉樣變性、炎性浸潤以及氧化損傷等。有關(guān)AD發(fā)病機制的學(xué)說眾多，如蛋白異常學(xué)說、基因突變學(xué)說、突觸失活學(xué)說、線粒體功能紊亂學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、鈣平衡失調(diào)學(xué)說等。但到目前為止，其確切的病因及發(fā)病機制尚不清楚，一般認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，是一種多基因

4、相關(guān)疾病，具有明顯的家族聚集性，遺傳因素在其發(fā)病中起重要作用。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展及人類基因組計劃的進(jìn)行，尋找AD的遺傳易感基因并從基因水平闡明其發(fā)病機制成為醫(yī)學(xué)研究的熱點。大規(guī)模篩查AD的遺傳易感基因?qū)τ陂_展針對性的人群預(yù)防，延緩或防止AD的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　 到目前為止，已有一些基因被證實與AD的發(fā)病密切相關(guān)，如21號染色體的淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)基因、14

5、號染色體的早老素1基因（presenilin-1，PS-1）和1號染色體的早老素2基因（presenilin-2，PS-2）被認(rèn)為與早發(fā)型家族性AD相關(guān)，而載脂蛋白Eε4(Apolipoprotein Eε4，APOEε4)被公認(rèn)為與家族性和散發(fā)性AD都相關(guān)。
　　 最近的研究表明，腦內(nèi)細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)及其底物和代謝終產(chǎn)物可能參與了AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程。CYP為一類亞鐵血紅素

6、-硫醇鹽蛋白的超家族，在哺乳動物中主要存在于微粒體和線粒體中，參與大量的外源性物質(zhì)（藥物、化學(xué)毒物、致癌物等）和內(nèi)源性物質(zhì)（類固醇激素、維生素D、膽酸等）的代謝過程。在人類大腦，CYP參與的代謝途徑中，至少有兩條途徑的多種內(nèi)源性物質(zhì)與AD的發(fā)病密切相關(guān)。第一條途徑是膽固醇代謝及類固醇激素的生成途徑。腦是體內(nèi)膽固醇含量最高的組織，其膽同醇含量占人體總含量的20％，而腦組織本身只占人體質(zhì)量的2％。膽固醇為合成神經(jīng)細(xì)胞膜所必需，在髓鞘內(nèi)含量很

7、高，并形成脂質(zhì)筏，后者是裝配β和γ分泌酶及將APP加工為Aβ的平臺。當(dāng)酯化膽固醇過多時，膜脂轉(zhuǎn)運減少，可致Aβ生成和聚集增多而清除減少，導(dǎo)致AD發(fā)生。由于膽固醇不能通過血腦屏障，必須通過CYP46A1將其代謝為24s-羥基膽甾醇才能與外周進(jìn)行交流，因此，CYP46A1的功能狀態(tài)直接影響了腦內(nèi)膽固醇的水平，從而有可能參與了AD的發(fā)病過程。另外，膽固醇還可以在CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1等一些關(guān)鍵酶的作用下，生成一系列與A

8、D密切相關(guān)的類固醇激素，如妊娠素可以改善認(rèn)知障礙，脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活和分化、同時還具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用，雌激素則具有防止神經(jīng)元的死亡、選擇性地增加神經(jīng)元的可塑性以及減少Aβ在腦內(nèi)的沉積等神經(jīng)保護(hù)作用。因此，CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1這些關(guān)鍵酶的表達(dá)及活性必然有可能通過影響了上述類固醇激素的生成，從而參與了AD的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 另外一

9、條是花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)經(jīng)CYP表氧化酶途徑代謝的通路。大量的研究表明，AD的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著慢性炎癥反應(yīng)，而CYP表氧化酶則能把體內(nèi)的AA代謝成具有很強抗炎特性的環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)，更重要的是，在AD患者的大腦中，其CYP表氧化酶的mRNA及蛋白表達(dá)水平比健康人群顯著下降，因此，CYP表氧化酶的表達(dá)下降或功能缺失有可能參與了AD的發(fā)生發(fā)展過

10、程。在人體內(nèi)，參與EETs代謝的CYP表氧化酶主要有CYP2J2、CYP2C8和CYP2C9。除了CYP2C9并未見在腦內(nèi)有表達(dá)的報道，CYP2J2和CYP2C8均在大腦的多個組織中有豐富的表達(dá)，其中大腦皮層、額葉和海馬區(qū)的表達(dá)量最高，這些表達(dá)部位與AD患者腦內(nèi)Aβ的分布相吻合。綜上所述，本研究最終選取了參與膽固醇代謝及類固醇生成的關(guān)鍵酶CYP46A1、CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1，參與AA代謝生成EETs的關(guān)鍵酶CY

11、P2C8和CYP2J2，總共6個基因的12個多態(tài)性位點，然后采用病例-對照的方法，探討這些基因多態(tài)性與中國漢族人群散發(fā)性阿爾茨海默病的相關(guān)性。此外，由于APOE基因ε4等位基因為目前所公認(rèn)的散發(fā)型和遲發(fā)型阿爾茨海默癥的危險因素，本研究打算選取該基因型作為分層因素，進(jìn)一步探討以上的CYP多態(tài)性位點與散發(fā)性AD的關(guān)系。
　　 研究對象:
　　 本研究在廣州市老人院、廣州市腦科醫(yī)院和廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院收集散發(fā)性AD患者和健康對

12、照者的外周血標(biāo)本，共收集到AD病例組207個例，健康對照組256例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，AD組與健康對照組年齡和性別匹配，具有可比性。
　　 1.AD受試患者入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥65歲，漢族，無血緣關(guān)系;
　　 ②簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評分文盲≤17分，小學(xué)≤20份，中學(xué)及以上≤24分;
　　 ③根據(jù)美國精神病學(xué)會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第Ⅳ版(DSM-Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)(American PsychiatricAssoci

13、ation2000)診斷有阿爾茨海默型的癡呆;
　　 ④根據(jù)美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(NINCDS-ADRDA)的標(biāo)準(zhǔn)臨床診斷為可能的AD患者。
　　 排除標(biāo)準(zhǔn):①血管性癡呆及系統(tǒng)性疾病和物質(zhì)中毒所致的癡呆;
　　 ②抑郁導(dǎo)致的假性癡呆;
　　 ③合并其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腦血管疾病;
　　 ④正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者及惡性腫瘤患者。

14、
　　 2.健康對照者納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥70歲，漢族，無血緣關(guān)系;
　　 ②MMSE評分正常無癡呆;
　　 ③無腦血管病及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病;
　　 排除標(biāo)準(zhǔn):①確診惡性腫瘤患者;
　　 ②正處于心血管、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者。
　　 研究方法:
　　 實驗對象空腹8小時以上，靜脈抽取5ml外周血置于EDTA-K2抗凝管中，按人血液DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DN

15、A，然后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行基因型分析。同時收集每一例受試者的總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇(high densityliprotein eholesterol，HDL-C)等相關(guān)的臨床指標(biāo)。
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPS

16、S13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用雙側(cè)t檢驗比較AD組與對照組符合正態(tài)分布的計量資料;等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律、組間的基因型頻率以及等位基因頻率分析均采用x2檢驗，危險因素分析采用多元logistic回歸分析;連鎖不平衡(Linkage disequilibrium，LD)分析采用Haploview4.2軟件，單體型分析采用PHASE2.0分析軟件;以雙側(cè)P＜0.0

17、5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對207例散發(fā)性AD患者和239例健康對照者的基因組DNA進(jìn)行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP46A1(rs3783320，rs3742376)、CYP11A1(rs4887139, rs11638442)、CYP17A1(rs3824755, rs743572)和CYP19A1(rs3751592，rs1065778)基因分型，結(jié)

18、果顯示:①APOEε4基因型在AD組中的分布頻率明顯高于對照組，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。②通過對各CYP亞型的基因型和等位基因分析，我們發(fā)現(xiàn)CYP17A1-rs3824755的基因型(GGvs.GC+CC)在AD組與對照組中的分布具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.044)，表現(xiàn)為保護(hù)作用;CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AAvs.AG+GG)在兩組間的分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.042，P=0.036)，兩者

19、均增加了AD的發(fā)病風(fēng)險。③當(dāng)以是否攜帶APOEε4進(jìn)行分層分析后發(fā)現(xiàn)，CYP17A1-rs3824755的G等位基因在APOEε4攜帶者的人群中對AD起保護(hù)作用(P=0.001);CYP17A1-rs743572的A等位基因在APOEε4攜帶者的人群中增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.037); CYP19A1-rs3751592的A等位基因在APOEε4攜帶者與非攜帶者人群中均增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.004，P=0.002)，同時，

20、其基因型(AAvs.AG+GG)在APOEε4攜帶者的人群中也增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.006)。④在單體型分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，CYP46A1的單體型G-C在兩組中分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.050)，表現(xiàn)為保護(hù)作用。當(dāng)以是否攜帶APOEε4進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)在攜帶ApoEε4的人群中，CYP46A1的單體型G-C和CYP17A1的單體型C-G對AD具有保護(hù)作用(P=0.038，P=0.001)，而CYP17A1的單體型G-A和CYP19

21、A1單體型A-G則增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.037，P=0.004)。⑤采用logistic回歸分析排除傳統(tǒng)危險因素的影響之后發(fā)現(xiàn)，只發(fā)現(xiàn)ApoEε4為AD的風(fēng)險因素，但未發(fā)現(xiàn)任何CYP的SNPs位點與AD發(fā)病存在相關(guān)性。
　　 2.采用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對206例散發(fā)性AD患者和256例健康對照者的基因組DNA進(jìn)行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP2C8(rs1058392，rs2275622)和CYP2

22、J2(rs1155002，rs2271800)基因分型，結(jié)果顯示:①APOEε4基因型在AD組中的分布頻率明顯高于對照組，兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。②通過對各CYP亞型的基因型和等位基因分析，我們未發(fā)現(xiàn)任何CYP的SNPs位點與AD發(fā)病存在相關(guān)性;而當(dāng)以是否攜帶APOEε4進(jìn)行分層分析后發(fā)現(xiàn)，在攜帶ApoEε4的人群中，CYP2J2-rs1155002的C等位基因和基因型(CC vs.CT+TT)在兩組間的分布均有統(tǒng)計學(xué)差

23、異(P=0.044，P=0.044)，并均表現(xiàn)為保護(hù)作用。③在單體型的分析中發(fā)現(xiàn)，CYP2C8的單體型C-T增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P＜0.001)，而單體型T-C降低了AD的發(fā)病風(fēng)險(P＜0.001);而在攜帶ApoEε4的人群中，CYP2C8的單體型C-T增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.009)，CYP2C8的單體型T-C和CYP2J2的單體型A-T則降低了AD的發(fā)病風(fēng)險(P=0.023，P=0.044);在ApoEε4非攜帶者人群中，

24、CYP2C8的單體型的發(fā)病風(fēng)險與總體人群分析結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.ApoEε4增加中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風(fēng)險。
　　 2.CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AA vs.AG+GG)增加了中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風(fēng)險。
　　 3.CYP46A1(rs3783320，rs3742376)單體型G-C降低了中國漢族散發(fā)性AD的發(fā)病風(fēng)險。
　　 4.CYP2C8(rs