豬源OAS蛋白抗JEV的特性研究.pdf

1、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱(chēng)流行性乙型腦炎病毒，為單股正鏈RNA病毒，與西尼羅河病毒(WNV)、登革熱病毒(DENV)、蜱傳性腦炎病毒(TBEV)和黃熱病病毒(YFV)等醫(yī)學(xué)上重要的致病性病毒同屬于黃病毒科黃病毒屬。流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B/JE)是由JEV引起的一種重要的蚊媒性人獸共患傳染病，主要引發(fā)人類(lèi)的腦炎和豬的繁殖障礙性疾病，其爆發(fā)或流

2、行具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。隨著JE的流行和擴(kuò)散，該病極有可能成為一種全球性傳染病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物的健康，因此，切實(shí)有效地防控JEV對(duì)于建立健康良好的全球公共衛(wèi)生環(huán)境具有積極重要的意義。
　　2'-5'寡腺苷酸合成酶（2'-5'Oligoadenylate Synthesis，OAS）是一種由Ⅰ型或Ⅱ型干擾素(Interferon，IFN)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白，在IFN介導(dǎo)的抗病毒通路中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也參與其它的細(xì)胞進(jìn)程，

3、例如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、基因調(diào)控、DNA復(fù)制及RNA剪切等。目前，關(guān)于哺乳動(dòng)物OAS蛋白的生物學(xué)活性（尤其是抗病毒活性）已有愈來(lái)愈多的研究報(bào)道，但與其相關(guān)的生物作用機(jī)制并未被揭示清楚，仍然有待后續(xù)的探討與研究。
　　OAS基因?qū)儆谝粋€(gè)保守的基因家族，與其它的干擾素刺激基因（Interferon-stimulated gene，ISG）不存在明顯的序列同源性。OAS家族由四個(gè)不同亞型組成:OAS1，OAS2，OAS3和OASL

4、。豬源OAS與人源和鼠源的OAS具有高度的同源性。豬源OAS1與人源OAS1具有73％的序列同源性，并且具有相似的酶催化特性。OAS蛋白的重要功能是利用ATP催化合成2'-5'寡腺苷酸(2-5A)，隨后2-5A激活核糖核酸內(nèi)切酶(RNaseL)，活化的RNaseL能夠降解胞內(nèi)的病毒RNA和細(xì)胞RNA，從而導(dǎo)致在病毒感染過(guò)程中細(xì)胞肉蛋白的合成整體受到抑制，病毒的增殖隨之受到抑制。
　　黃病毒的抗性基因(Flvr)已被兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分別

5、證實(shí)為OAS1b基因，且在野生小鼠中能夠抑制西尼羅河病毒(WNV)的增殖。Lin等發(fā)現(xiàn)人源的OAS1(p42、p46)和OAS3(p100)具有較強(qiáng)的抗登革熱病毒(DENV)的活性。Kwon等證實(shí)OAS1(p46)和OAS3(p100)是依賴(lài)于RNase L從而抑制丙肝病毒(HCV)的感染。此外，外源性O(shè)AS1能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且無(wú)論在體內(nèi)或體外均具有強(qiáng)大的抗病毒活性。此后，Thavachelvam等發(fā)現(xiàn)外源性O(shè)AS1在病毒復(fù)制早期發(fā)揮

6、重要作用。人的OAS1的SNP(rs10774671)上的等位基因A，不僅與OAS1的剪切及其酶活性相關(guān)，而且影響OAS抗WNV的活性，可作為人類(lèi)初次感染W(wǎng)NV的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志基因。此外，Bigham等發(fā)現(xiàn)，OAS1的另外1個(gè)SNP(rs34137742)也與顯性感染W(wǎng)NV有關(guān)，并關(guān)系到該疾病的發(fā)展進(jìn)程。Rios等研究表明，馬的OAS1具有抵抗WNV感染的活性，其在自然條件下發(fā)生的單核苷酸突變會(huì)增加宿主對(duì)WNV的易感性?？紤]到JEV與WNV的

7、親緣關(guān)系相近，可以推測(cè)OAS基因的多態(tài)性可能也與JEV的易感性相關(guān)，但該方面的研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。
　　1.豬源OAS蛋白抗JEV感染的特性
　　2'-5'寡腺苷酸合成酶(OAS)是一類(lèi)具有抗病毒活性的蛋白，并且人源和鼠源的多種亞型已被證實(shí)能夠作為抗黃病毒的生物標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)豬源OAS家族基因在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性的特點(diǎn)。JEV感染能夠刺激OAS1快速高效地表達(dá)，在24hpi升高5.7倍，表達(dá)效率明

8、顯高于OAS2（3.1倍）和OASL（1.5倍）。PK-15細(xì)胞瞬時(shí)過(guò)表達(dá)OAS1a和OASL能夠顯著抑制JEV的增殖。而RNA干擾技術(shù)介導(dǎo)的OAS2基因的瞬時(shí)沉默更能促進(jìn)JEV的增殖，促使病毒基因組上升7.99倍，顯著高于OAS1和OASL組的4.5倍。共同沉默OAS基因和RNase L基因的結(jié)果表明，OAS1和OAS2依賴(lài)于OAS/RNase L途徑發(fā)揮抗JEV的活性，而OASL具有其它的抗病毒途徑。綜上，豬源OAS各亞型在抗JEV

9、感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但對(duì)于具有特殊蛋白結(jié)構(gòu)的OASL，其抗病毒機(jī)制仍需更加深入的研究。
　　2.豬源OAS1基因SNP對(duì)JEV感染的影響
　　人源OAS1的多態(tài)性已被證實(shí)與多種具有重要公共衛(wèi)生意義的感染性疾病的不同易感性相關(guān)，包括丙肝病毒(HCV)、SARS冠狀病毒和西尼羅河病毒。豬的OAS1蛋白也具有抗JEV的活性。本研究旨在探究豬OAS1的單核苷酸多態(tài)性(SNP)對(duì)JEV病毒感染的影響。本實(shí)驗(yàn)利用原有不同品種和乙腦發(fā)

10、病狀況的豬的組織樣品的測(cè)序結(jié)果分析得到18個(gè)非同義編碼區(qū)的SNP，并據(jù)此位點(diǎn)進(jìn)行OAS1基因的單核苷酸突變構(gòu)建真核表達(dá)載體。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M13(Q174K)和M16(D277N)兩個(gè)突變體可能因?yàn)閱蝹€(gè)氨基酸突變而引起蛋白發(fā)生變化，從而導(dǎo)致抗病毒活性的顯著缺失，即上述兩組的病毒基因組分別為對(duì)照組的87.1％和97.2％。然而回溯分析并未確定突變位點(diǎn)與JEV易感性的關(guān)聯(lián)顯著。此外，OAS1及其突變體在IFN系統(tǒng)不完整的BHK-21和Ver