兩株抗JEV單抗可變區(qū)的基因克隆、計(jì)算機(jī)建模及其與JEV E蛋白的分子對(duì)接.pdf

1、日本腦炎病毒(JEV)是黃病毒科、黃病毒屬主要成員,病毒通過蚊子叮咬傳播,可引起人類急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染性疾病—日本腦炎(我國(guó)也稱流行性乙型腦炎,簡(jiǎn)稱乙腦),主要發(fā)病人群為兒童,重癥病死率較高,近三分之一的幸存者留有各種各樣的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,仍然嚴(yán)重威脅公眾健康。隨著全球氣候暖化,日本腦炎病毒的流行地域也不斷擴(kuò)大,成為全球性的公共衛(wèi)生問題。
　　JEV E蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,參與病毒吸附、穿入,與其致病性密切相關(guān)。本課題

2、組制備了兩株具有高中和活性的抗JEV單克隆抗體(2H4和2F2),并在多種感染動(dòng)物模型上證實(shí)了其顯著的被動(dòng)保護(hù)作用,但抗體與JEV相互作用的機(jī)制尚未完全闡明。因此,本研究利用分子生物學(xué)方法獲得2H4和2F2抗體可變區(qū)基因,原核表達(dá)并純化了2H4和2F2重鏈可變區(qū),確認(rèn)了原核表達(dá)的重鏈可變區(qū)產(chǎn)物與JEV的結(jié)合活性,利用計(jì)算機(jī)軟件構(gòu)建了2H4和2F2可變區(qū)的空間模型,再與已有的JEV E蛋白空間模型進(jìn)行了模擬分子對(duì)接,了解了對(duì)抗體結(jié)合活性有

3、重要影響的關(guān)鍵氨基酸,為最終闡明抗體中和作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.確定了2H4、2F2可變區(qū)基因
　　培養(yǎng)2H4、2F2雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)RNA提取試劑RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)GenBank中鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因序列,設(shè)計(jì)出分別針對(duì)FR1和FR4的上、下游引物,以總 RNA為模板擴(kuò)增2H4、2F2可變區(qū)基因。進(jìn)行了2H4、2F2重鏈和輕鏈可變區(qū)基因核苷酸序列同源性分析(BLA

4、STN,此過程在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行),并用IMGT/V-QUEST分析了可變區(qū)結(jié)構(gòu),確定了2H4、2F2單抗可變區(qū)CDR和FR。結(jié)果顯示,這些序列包含典型的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域以及 FR1～FR4區(qū)域,完全符合鼠源性 IgG抗體可變區(qū)基因的特征。2H4、2F2輕鏈可變區(qū)基因均長(zhǎng)321 bp,編碼107個(gè)氨基酸,第92位含一個(gè)半胱氨酸,并且序列完全相同。2個(gè)重鏈可變區(qū)基因序列長(zhǎng)354 bp,

5、編碼118個(gè)氨基酸,第22位和第96位含有維持抗體結(jié)構(gòu)的半胱氨酸。
　　2.原核表達(dá)了2H4、2F2重鏈可變區(qū)并確認(rèn)了與JEV的結(jié)合活性
　　為了便于純化,選用pRSET A載體。2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析純化、透析,間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)2H4、2F2重鏈可變區(qū)表達(dá)產(chǎn)物可與JEV結(jié)合。
　　3.2H4、2F2單抗可變區(qū)的同源建模
　　根據(jù)2H4、2F2可變區(qū)基因,利用BLASTP軟件(ww

6、w.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTP)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中搜索相關(guān)蛋白,獲得了單抗可變區(qū)的同源蛋白,完成了氨基酸序列同源性分析。利用軟件MODELLER9v1,以同源蛋白為模板對(duì)單抗可變區(qū)的主鏈、側(cè)鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模,組裝出完整的2H4、2F2單抗可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)模型,再對(duì)初始結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行了一系列分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,最終獲得了單抗可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)的能量最低構(gòu)象。
　　4.2H4、2F2單抗可變區(qū)與JEV E蛋白的模擬分子對(duì)

7、接
　　利用Discovery Studio v2.1軟件模擬了單抗可變區(qū)與E蛋白的分子對(duì)接,結(jié)果顯示:E蛋白上與2H4單抗可變區(qū)作用的氨基酸位點(diǎn)有5個(gè),分別是16位絲氨酸、37位天冬氨酸、353位精氨酸、375位谷氨酸和378位苯丙氨酸殘基;2F2單抗可變區(qū)作用則有9個(gè),分別是13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸、300位蘇氨酸、336位賴氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸殘基。在所有位

8、點(diǎn)中,13位谷氨酸、16位絲氨酸、37位天冬氨酸和300位蘇氨酸在E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ區(qū)內(nèi),其余均在已報(bào)道過的E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ區(qū)內(nèi)。2H4、2F2單抗同時(shí)識(shí)別的16位絲氨酸和37位天冬氨酸可能是結(jié)構(gòu)域Ⅰ區(qū)中和表位的關(guān)鍵氨基酸所在。2F2的13位谷氨酸和300位蘇氨酸也未曾報(bào)道。2H4的353位精氨酸未見報(bào)道,但375位谷氨酸和378位苯丙氨酸與2F2的387位精氨酸和388位甘氨酸均位于優(yōu)勢(shì)中和抗原表位集中的結(jié)構(gòu)域Ⅲ區(qū)內(nèi)。2F2的336位賴氨酸