PmrA-PmrB二元調(diào)控系統(tǒng)介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)黏桿菌素的耐藥機(jī)制.pdf

1、大腸桿菌作為人畜腸道菌群重要的一員，對(duì)維持腸道正常生理功能具有重要意義，但某些致病性大腸桿菌可引起動(dòng)物腹瀉，泌尿道感染等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。近年來(lái)，多藥耐藥大腸桿菌的傳播已經(jīng)引起世界的廣泛關(guān)注，黏桿菌素作為治療大腸桿菌的最后一道防線又重新應(yīng)用于臨床，但同時(shí)黏桿菌素耐藥株也開(kāi)始在臨床出現(xiàn)。本文對(duì)二元調(diào)控系統(tǒng)PmrA/PmrB介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)黏桿菌素的耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探討，旨在為有效控制耐藥菌傳播與擴(kuò)散提供理論依據(jù)。
　　一、

2、pmrA/pmrB突變對(duì)耐藥大腸桿菌的影響
　　為探討pmrA/pmrB突變是否介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)黏桿菌素的耐藥，本試驗(yàn)首先測(cè)定臨床分離大腸桿菌對(duì)黏桿菌素的最低抑菌濃度(MIC)，然后通過(guò)step-wise方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)得到5株耐藥菌（9R、36R、53 R、91R和107R），PCR擴(kuò)增并連接T載體后對(duì)所有親本株及耐藥株pmrA/pmrB測(cè)序，同時(shí)對(duì)耐藥菌的細(xì)胞膜特性（Zeta電位）、抗生素敏感性等進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5株耐藥菌MI

3、C達(dá)到16μg·mL-1以上時(shí)，pmrB會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變或插入突變，其中9R(G55A)、36R(T500 C)和53R(T263 A)菌株分別在55、500和263位發(fā)生點(diǎn)突變，91R(30 bp)和107R(189 bp)菌株分別在229和478位插入30 bp和189 bp，但所有耐藥菌的pmrA未發(fā)生突變;所有耐藥菌Zeta電位均極顯著下降（P＜0.01）;不同耐藥菌對(duì)頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和四環(huán)素的敏感性均有不同程

4、度上升。此外，電鏡結(jié)果顯示黏桿菌素耐藥菌細(xì)胞外膜缺失，對(duì)黏桿菌素具有抗性，而敏感菌經(jīng)黏桿菌素處理后，細(xì)胞會(huì)破裂。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的耐藥菌（MIC介于4～8μg·mL-1）的pmrA和pmrB均未發(fā)生突變，推測(cè)存在其它耐藥機(jī)制，有待進(jìn)一步揭示。
　　二、pmrA/pmrB回復(fù)突變株構(gòu)建及pmrA/pmrB mRNA表達(dá)量測(cè)定
　　為進(jìn)一步探討誘導(dǎo)耐藥菌株的pmrB插入片段是否是引起大腸桿菌對(duì)黏桿菌素耐藥的關(guān)鍵因素，本試驗(yàn)

5、在體外篩選得到帶有pmrB插入片段的耐藥菌(91R、107R)的基礎(chǔ)上，采用red同源重組方法構(gòu)建了這兩株菌的pmrA/pmrB回復(fù)突變株，同時(shí)測(cè)定回復(fù)突變株的表型及pmrA/pmrB mRNA表達(dá)量變化。此外，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)所有耐藥菌株pmrA/pmrB mRNA表達(dá)量變化。結(jié)果顯示所有誘導(dǎo)耐藥菌pmrA/pmrB的表達(dá)量均較親本株高，其中發(fā)生點(diǎn)突變的三株耐藥菌（9R、36R和53R）pmrA/pmrB的表達(dá)量均顯著（P＜0.

6、05）或極顯著（P＜0.01）上升，而91R和107R菌株（含有插入片段）的pmrA/pmrB表達(dá)量雖有上升趨勢(shì)但不顯著（P＞0.05）。所有耐藥菌株的回復(fù)突變株對(duì)黏桿菌素恢復(fù)敏感，pmrB表達(dá)水平顯著下降至親本株的表達(dá)水平(P＜0.05)，pmrA的表達(dá)量雖有下降趨勢(shì)但變化不顯著（P＞0.05）。
　　三、pmrA/pmrB突變對(duì)大腸桿菌體外適應(yīng)性代價(jià)研究
　　在體外誘導(dǎo)獲得帶有突變位點(diǎn)耐藥菌的基礎(chǔ)上，本研究采用體外競(jìng)爭(zhēng)試

7、驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定所有耐藥菌及相應(yīng)親本株的生長(zhǎng)曲線并根據(jù)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析了pmrA/pmrB突變對(duì)大腸桿菌的適應(yīng)性代價(jià)。結(jié)果顯示，各耐藥菌株最大生長(zhǎng)速率均有上升趨勢(shì)但變化不顯著(P＞0.05)，36R、53R和91R菌株的生長(zhǎng)世代時(shí)間均顯著升高（P＜0.05），所有耐藥菌的體外適應(yīng)性較親本株均極顯著降低(P＜0.01)。
　　綜上所述，pmrB點(diǎn)突變及插入突變伴隨pmrA/pmrB高表達(dá)是介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)黏桿菌素耐藥的主要機(jī)制之一，耐藥