TGF-β1和核心蛋白多糖對Tenon囊成纖維細胞增殖和熱休克蛋白47基因表達影響的實驗研究.pdf

1、研究背景： 青光眼是一種嚴重致盲性眼病，降低眼內壓是青光眼治療的一個主要措施，濾過性手術具有較好的降壓效果，目前被認為是控制眼壓最有效的方法，然而由于創(chuàng)傷修復愈合，濾過口部位成纖維細胞增殖和膠原形成，可導致濾過通道閉合，嚴重影響青光眼濾過性手術的成功率。針對青光眼手術后瘢痕的形成，目前主要的對抗手段是術中術后采用抗瘢痕藥物，臨床上應用較廣泛的是絲裂霉素C(MMC)和5．氟尿嘧啶(5-FU)，這兩種抗代謝藥物的應用顯著地提高了青光

2、眼濾過性手術的成功率，但是也不可避免損傷鄰近眼部組織，對結膜、角膜、鞏膜、睫狀體、小梁網(wǎng)等組織都有一定的毒副作用。尋找一種療效高、特異性強、毒副作用小的抗瘢痕藥物已成為近年來青光眼研究的熱點。 熱休克蛋白47(HSP47)是一種分子量為47KD的蛋白，在內質網(wǎng)中能與多種類型膠原和前膠原特異性結合，HSP47作為膠原合成有關的“分子伴侶”，參與前膠原在內質網(wǎng)中的折疊、裝配、修飾和轉運等過程，對膠原分子合成質量控制起重要的作用，能夠

3、防止錯誤構型的前膠原分泌出內質網(wǎng)。HSP47在創(chuàng)傷修復過程中表達增強，且在全身部分纖維化疾病病理過程中發(fā)揮重要作用。 轉化生長因子β1(TGF-β1)能促進全身許多纖維組織HSP47的表達，青光眼濾過手術失敗主要因為膠原的增殖。尚不清楚，TGF-β1能否通過促進Tenon囊成纖細胞增殖和促進HSP47和I型膠原表達，導致膠原的大量產(chǎn)生，促進正常Tenon囊成纖維細胞纖維化，本實驗首次研究HSP47在青光眼濾過手術后Tenon囊成

4、纖維細胞的表達，同時研究TGF-β1抑制劑核心蛋白多糖(Decorin)能否有效抑制Tenon囊成纖細胞HSP47和I型膠原mRNA表達，探討青光眼濾過手術后瘢痕形成可能的分子機理及其可能的對抗手段。 目的： 體外培養(yǎng)Tenon囊成纖維細胞，研究TGF-β1和Decorin對體外培養(yǎng)的Tenon囊成纖維細胞增殖、HSP47及膠原基因表達水平的影響；研究青光眼濾過手術區(qū)域Tenon囊成纖維細胞HSP47和膠原纖維的表達；研

5、究Decorin對濾過手術區(qū)域Tenon囊成纖維細胞HSP47和膠原纖維表達的影響；探討HSP47在青光眼濾過手術后瘢痕形成中的作用，以及Decorin抗瘢痕形成的分子機理。 方法： 1．取新近發(fā)病的需要手術的青光眼患者的Tenon囊組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細胞。 2．不同濃度的TGF-β1和Decorin對Tenon囊成纖維細胞作用不同時間，MTT比色法檢測二者對Tenon囊成纖維

6、細胞增殖的影響。 3．以不同濃度的TGF-β1和Decorin對Tenon囊成纖維細胞作用不同時間，實時熒光定量PCR技術檢測其對Tenon囊成纖維細胞I型膠原纖維和HSP47的基因表達的影響。 4．兔眼濾過手術制作抗青光眼手術動物模型，18只兔(36眼)隨機分組，16只兔(32眼)左眼均為對照組，右眼均為實驗組，2只兔(4眼)不做手術為正常對照組。實驗組和對照組均行濾過手術，實驗組分別于術備、術后1d、3d球結膜下注射

7、Decorin,對照組在相同的時間球結膜注射BSS，術后觀察結膜傷口愈合，結膜充血，濾過泡大小，角膜透明度，前房反應，晶狀體透明度，眼壓，分別于手術后第5d、7d、15d、30d分批處死兔子，每次4只，完整取下眼球，4％甲醛固定液固定72h，免疫組織化學檢測Decorin對濾過手術區(qū)HSP47和膠原纖維表達的影響。 結果： 1．體外成功培養(yǎng)Tenon囊成纖維細胞，培養(yǎng)的細胞生長活躍，形狀穩(wěn)定，細胞經(jīng)過冷凍與復蘇后，仍能保

8、持其原來的細胞形態(tài)結構與穩(wěn)定的生物學特性。 2．lng/ml及以上濃度的TGF-β 1可促進Tenon囊成纖維細胞的增殖，并與濃度成正比；1μg／ml及以上濃度的Decorin對Tenon囊成纖維細胞的增殖有抑制作用，抑制作用與濃度成正比；Decorin能抑制TGF-β 1促Tenon囊成纖維細胞增殖作用，其抑制作用呈劑量依賴性。 3．lng／ml及以上濃度的TGF-β 1促進Tenon囊成纖維細胞HSP47和Ⅰ型膠原

9、纖維mRNA表達，作用呈劑量依賴性。5ng/ml TGF-β 1刺激Tenon囊成纖維細胞不同時間后，HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達逐漸增強，48hHSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達達高峰，HSP47 mRNA表達為對照組的2.945倍，Ⅰ型膠原mRNA表達為對照組的3.140倍。 4．Decorin能抑制TGF-β 1誘導Tenon囊成纖維細胞HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達，不同濃度的Decorin(0.01～5μg/ml

10、)和5ng/ml的TGF-β1混合，1μg／ml及以上濃度的Decorin對TGF-βl誘導Tenon囊成纖維細胞的HSP47和Ⅰ型膠原mRNA表達有抑制作用。 5．Decorin能預防青光眼濾過手術后瘢痕的形成，有效降低濾過手術后眼壓，能形成良好的濾過泡，沒有明顯的眼部并發(fā)癥。實驗組眼壓能較長時間的維持在低于正常眼壓水平，術后30d濾過泡隆起、彌散，大部分為功能性濾泡，而對照組局限、平坦、面積小，全為非功能性濾過泡。 6．免

11、疫組織化學方法檢測HSP47在青光眼濾過手術后的表達，對照組在濾過手術后5dHSP47表達增加，在7dHSP47表達達到峰值，術后15dHSP47表達逐漸下降，但仍明顯高于術前水平且維持到術后30d，而實驗組結膜濾過泡免疫組化染色稀疏、密度低，HSP47的表達弱陽性，術后第5d，7d，15d、30dHSP47表達明顯低于同時期的對照組。 7．天狼星玫瑰紅染色組織切片檢測濾過術后Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維變化規(guī)律，對照組可見大量的Ⅰ型和Ⅲ

12、型膠原纖維，且緊密排列，隨著手術后觀察時間越長，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的密度越大，30d膠原纖維的密度最高。實驗組Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維排列稀疏、密度較低，相同時期的實驗組和對照組比較，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維密度有顯著性差異，Decorin可以抑制HSP47的表達和膠原纖維合成，減少局部組織纖維化。 結論： 1．TGF-β1能促進Tenon囊成纖維細胞的增殖，并刺激Tenon囊成纖維細胞誘導HSP47和Ⅰ型膠原基因的表達，TGF-β

13、1刺激成纖維細胞增殖的作用可能與青光眼濾過術后濾過道瘢痕化有關。 2．Decorin能抑制Tenon囊成纖維細胞增殖、抑制HSP47和膠原基因的表達，可以通過與受體結合，直接干擾TGF-β1的細胞信號轉導，影響HSP47和膠原基因的表達，并可通過此機制發(fā)揮其在青光眼術后抗瘢痕作用。 3．青光眼濾過術后HSP47和TGF-β1的表達規(guī)律基本一致，機制可能是青光眼濾過術后高表達的TGF-β1作用于HSP47的順式作用原件，進