鮸魚鰻弧菌感染相關(guān)microRNA的鑒定及分析.pdf

1、鮸魚(Miichthys miiuy)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋水產(chǎn)魚類，屬于石首科，主要分布在太平洋西北部:從日本海西部到中國東海區(qū)域。近年來，鮸魚被廣泛養(yǎng)殖，但是，其養(yǎng)殖規(guī)模一直受到許多病原菌和寄生蟲帶來的各種感染性疾病所限制。目前，基于鮸魚轉(zhuǎn)錄組和EST測序數(shù)據(jù)，許多免疫相關(guān)基因已展開研究。MicroRNA(miRNA)是一大類內(nèi)生非編碼小分子RNA(small RNA，sRNA)，它能夠通過不完全互補(bǔ)配對形式靶作用于信使RNA

2、(mRNA)，并可在轉(zhuǎn)錄后水平上通過抑制mRNA翻譯或者誘導(dǎo)mRNA降解的方式調(diào)控各種生理過程。研究表明miRNA在宿主對抗各種病原體感染過程中起到關(guān)鍵作用。作為一種革蘭氏陰性，鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是鮸魚養(yǎng)殖過程中一種常見的病原菌。為了鑒定在鰻弧菌侵染時(shí)起到免疫調(diào)控作用的miRNA，我們對健康的鮸魚和受鰻弧菌侵染的鮸魚的脾臟組織進(jìn)行了sRNA轉(zhuǎn)錄組測序。本研究通過sRNA轉(zhuǎn)錄組測序，得到的主要結(jié)論如下:

3、　　1.構(gòu)建了兩個(gè)sRNA文庫并通過Illumina高通量測序平臺進(jìn)行測序。經(jīng)過低質(zhì)量序列的過濾，在對照組(control group，CG)與感染組(infected group，IG)文庫中分別獲得了12，052，153和11，150，433條clean reads?；邗|魚基因組序列，鑒定了241個(gè)保守的和137個(gè)novel miRNA前體，分別編碼293個(gè)和124個(gè)成熟的miRNA。
　　2.分析了分布在正義轉(zhuǎn)錄本上的23

4、3個(gè)保守miRNA的家族分類，其中229個(gè)miRNA歸類于91個(gè)基因家族，另外4個(gè)miRNA(mmi-miR-2184-1，mmi-miR-2184-2，mmi-miR-8159，mmi-miR-8161)未歸類到任何家族。80.7％(188)的保守miRNA基因歸屬于50個(gè)miRNA家族，這些家族在鮸魚基因組中至少由兩個(gè)成員組成，其中最大的兩個(gè)家族是let-7和mir-10，它們分別包含19和11個(gè)旁系同源基因。為了研究這些基因家族的

5、進(jìn)化保守性，我們把這91個(gè)保守的miRNA家族，根據(jù)這些miRNA基因在動物界的分布，分成6大類。miRNA基因家族進(jìn)化分析結(jié)果顯示，miRNA在脊椎動物起源初期發(fā)生過一次數(shù)量的大爆發(fā)，并且當(dāng)一個(gè)基因家族在一個(gè)支系中產(chǎn)生后就很少再次缺失。
　　3.鑒定了10個(gè)反義起源的miRNA，其中8個(gè)(mmi-antisense-miR-100-1，miR-100-2，miR-16-1，miR-193，miR-21-1，miR-181a-3，

6、let-7a-1 and let-7b-1)來源于保守miRNA基因位點(diǎn)。盡管miR-100基因位點(diǎn)的正義鏈與反義鏈都表達(dá)，但是兩個(gè)miRNA的5p成熟體的“種子序列”不同。因此。反義miRNA轉(zhuǎn)錄本是新miRNA起源的途徑之一。
　　4.通過這兩個(gè)庫的數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA。與CG庫相比，其中6個(gè)miRNA是表達(dá)上調(diào)的，另外6個(gè)是表達(dá)下調(diào)的。我們進(jìn)一步對6個(gè)miRNAs(mmi-miR-122,mmi-m

7、iR-143,mmi-miR-455,mmi-miR-192,mmi-miR-375,mmi-miR-3570)進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。盡管測序結(jié)果與熒光定量結(jié)果間倍數(shù)變化存在差異，但是它們的變化趨勢是一致的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果說明我們的高通量測序數(shù)據(jù)是可信的，能夠揭示免疫相關(guān)miRNA的表達(dá)變化。
　　5.對12個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測和功能分析，結(jié)果顯示這些miRNA參與多條免疫相關(guān)信號通路的調(diào)控。

8、這些差異表達(dá)的miRNA能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控TLRs(Toll-Like Receptors，TLRs)或者TLR相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活TLR信號通路的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、IRF5、NF-κB和IRF3，這些轉(zhuǎn)錄因子能夠引起有效的宿主免疫反應(yīng)來清除感染的病原體。
　　本研究對鰻弧菌感染前后的鮸魚miRNA進(jìn)行鑒定和特征分析。miRNA表達(dá)量和差異表達(dá)miRNA靶基因和功能預(yù)測綜合分析，有助于理解當(dāng)宿主與病原體相互作用