基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的鮸魚分子標(biāo)記篩選及基因差異表達(dá)分析.pdf

1、鮸魚，屬于石首魚科，是漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。目前由于病原菌和寄生蟲引起的疾病使鮸魚的大規(guī)模養(yǎng)殖受到限制，大大降低了鮸魚的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鮸魚轉(zhuǎn)錄組和基因組信息的缺乏限制了研究人員對(duì)鮸魚的發(fā)病機(jī)制和免疫系統(tǒng)的研究。本文中，我們首先構(gòu)建了健康鮸魚的肝臟、脾臟和腎臟的cDNA文庫并使用Illumina公司雙末端測(cè)序方法測(cè)序，用于鮸魚功能基因的發(fā)掘和分子標(biāo)記的開發(fā)。為了了解鮸魚感染哈維氏弧菌后的免疫機(jī)制和獲得大量高表達(dá)的免疫

2、基因，我們分別對(duì)健康的鮸魚脾臟(Ctrl)和感染哈維氏弧菌的鮸魚脾臟(Vha)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在本研究中，通過兩次鮸魚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，我們獲得的主要結(jié)論如下：
　　1.我們利用Illumina HiSeq2000高通量技術(shù)平臺(tái)對(duì)鮸魚肝臟、脾臟和腎臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過篩選掉低質(zhì)量的raw reads我們共獲得了25,760,602條clean reads，組裝得到69,071條unigenes。采用BLAST相似性比對(duì)方法把這些

3、序列比對(duì)NT, NR, Swiss-Prot和 KEGG數(shù)據(jù)庫，共有45,676條 unigenes得到了注釋。有8,423個(gè)unigenes獲得了GO注釋并分類到51個(gè)功能類別中，有21,662個(gè)unigenes被歸納到COG的25個(gè)功能分類，共有23,927條獲得了KEGG注釋，共參與123條代謝通路中。根據(jù)這些注釋，我們篩選得到了498個(gè)免疫相關(guān)基因，并根據(jù)功能分成了14類。
　　2.經(jīng)過篩選，我們?cè)?1,251條unige

4、nes中共獲得了14,885條SSR位點(diǎn)，其中雙堿基重復(fù)類型最多。從設(shè)計(jì)的87對(duì)引物中共篩選出58對(duì)微衛(wèi)星引物，其中25條為多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。這些位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2-9，平均等位基因數(shù)為3.88。觀測(cè)雜合度(Ho)為0.100-1.00，平均值為0.433；期望雜合度(He)為0.095-0.784，平均值為0.489。PIC值為0.005-0.991，平均PIC值為0.49。另外，我們還檢索到了8,510個(gè)預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，

5、其中包括6,182個(gè)轉(zhuǎn)換和2,328個(gè)顛換。
　　3.通過對(duì)鮸魚感染哈維氏弧菌前后脾臟的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們分別獲得50,339,252條 reads和50,661,542條 reads。通過與基因組比對(duì)篩選后，共得到37,410,818條clean reads，組裝得到78,176條unigenes，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　4.通過對(duì)這兩組樣本進(jìn)行表達(dá)定量分析，共有41,845個(gè)基因在Ctrl樣品中表達(dá)，有41,989個(gè)

6、基因在Vha樣品中表達(dá)。共獲得1,350個(gè)顯著性差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)的有782個(gè)，下調(diào)的有568個(gè)，并進(jìn)行了差異表達(dá)基因的GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。
　　5.依據(jù)差異表達(dá)基因的 GO富集分析和 KEGG信號(hào)通路富集分析，篩選獲得大量的免疫相關(guān)基因及其在哈維氏弧菌感染后的調(diào)控機(jī)制。如免疫球蛋白I gM、I gD和IgA，趨化因子及受體CCL19、CCL21、CCL25、CXCR3和CXCR7，以及補(bǔ)體C1Q、C