鰻弧菌感染相關(guān)的鮸魚(yú)差異表達(dá)基因的miRNA調(diào)控研究.pdf

1、在長(zhǎng)期的進(jìn)化進(jìn)程中，為抵抗病原生物進(jìn)化出免疫系統(tǒng)。脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)分為先天性免疫系統(tǒng)(Innate immunity)和獲得性免疫系統(tǒng)(Acquired immunity)。Toll/IL-1受體超家族(Toll/IL-1 receptor superfamily)是由TLR家族和IL-1R家族組成。這個(gè)新受體家族中的成員都含有Toll同源結(jié)構(gòu)域的TH結(jié)構(gòu)域，是由含有128個(gè)氨基酸殘基的10段保守序列組成的。這一信號(hào)通路成員是重要的模

2、式識(shí)別受體，在對(duì)抗外來(lái)入侵病原體的天然免疫中發(fā)揮著重要的作用。MicroRNA(miRNA)是約含22核苷酸的內(nèi)生非編碼的小分子RNA，作為一類(lèi)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平。miRNA可以通過(guò)特定的結(jié)合位點(diǎn)與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)通過(guò)不完全的互補(bǔ)配對(duì)方式引起該基因翻譯受阻或者直接降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。在本研究中，通過(guò)鮸魚(yú)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得病原菌感染后的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)的Toll/

3、IL-1受體超家族中成員進(jìn)行了miRNA調(diào)控研究，研究結(jié)論如下:
　　1.我們通過(guò)對(duì)鮸魚(yú)感染鰻弧菌前后的脾臟cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)照組(Ctrl)獲得51，853，370條raw reads和感染組(Van)獲得51，852，199條raw reads。通過(guò)與鮸魚(yú)參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)篩選，對(duì)照組獲得34，790，143條匹配的read，Van感染組獲得34，526，606條匹配的reads，這些read組裝成了47，971條

4、unigenes。然后，對(duì)兩組樣本進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜分析，獲得差異表達(dá)的基因2，482個(gè)，其中上調(diào)的有1，313個(gè)。然后，根據(jù)這些差異表達(dá)基因的GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析，獲得了一些與病原體感染后免疫相關(guān)的基因，其中包括Toll/IL-1受體家族的TLR1和IL-1R等，它們都是在鰻弧菌感染下表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)的基因。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1RI在鰻弧菌感染的鮸魚(yú)脾臟組織及LPS刺激的鮸魚(yú)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量都是顯

5、著升高的，進(jìn)一步證實(shí)了IL-1RI在免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。利用生物學(xué)信息學(xué)的方法，篩選出了可能與IL-1 RI3'UTR區(qū)域結(jié)合的miRNA，其中包括miR-192，并對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)出其可以被轉(zhuǎn)錄因子AP-1所調(diào)控。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-192可以抑制IL-1RI3'UTR野生型報(bào)告質(zhì)粒的熒光活性，但對(duì)突變型無(wú)作用，這證實(shí)miR-192對(duì)IL-1R的抑制效應(yīng)是嚴(yán)格依賴(lài)于“Seed region”與IL-1

6、RI mRNA之間的相互作用。熒光定量分析miR-192在鰻弧菌感染的脾臟組織和LPS刺激的鮸魚(yú)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量變化與IL-1 RI的變化趨勢(shì)相反，從而進(jìn)一步證實(shí)miR-192對(duì)IL-1RI表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　3.本研究發(fā)現(xiàn)，TLR1在鰻弧菌感染的鮸魚(yú)脾臟組織中的表達(dá)量是顯著上升的。LPS是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，對(duì)LPS刺激后的鮸魚(yú)脾臟及LPS刺激后的鮸魚(yú)巨噬細(xì)胞進(jìn)行TLR1表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)其表

7、達(dá)量是上調(diào)的。通過(guò)生物學(xué)信息學(xué)的方法及雙熒光素酶報(bào)告基因篩選出miR-217可靶作用TLR1的3'UTR。通過(guò)miR-217可以抑制TLR13'UTR野生型報(bào)告質(zhì)粒的熒光活性而對(duì)突變型無(wú)作用，驗(yàn)證了miR-217可以直接靶作用TLR13'UTR的“Seed region”。利用構(gòu)建的miR-217前體質(zhì)粒，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-217前體有類(lèi)似于miR-217模擬體的活性也可以靶作用TLR13'UTR而抑制熒光活性。另外